提高β-半乳糖苷酶转糖苷活性的分子结构研究

低聚半乳糖(GOS)是人类肠道双歧杆菌的增殖因子，能促进双歧杆菌的生长，改善肠道的微生态平衡，广泛应用在食品、医药、饲料等行业，具有诱人的开发应用前景。GOS通过β-半乳糖苷酶的转糖苷作用合成。β-半乳糖苷酶具有水解和转糖苷双重作用。大多数天然酶的转糖苷活性低，无法商业化应用。近年虽有通过分子改造提高酶的转糖苷活性的报道，但从分子结构层面系统解析如何提高转糖苷活性的研究还鲜有报道。本申请选取有良好工作基础的亮白曲霉β-半乳糖苷酶为试验材料，运用生物信息学知识对酶的3D结构及催化、转糖苷活性相关位点进行预测，采用定点饱和突变技术高通量筛选获得转糖苷活性提高的突变酶。这一研究将为从酶蛋白结构的层面解析影响β-半乳糖苷酶转糖苷特性的关键因素，阐明糖苷酶水解与转糖苷反应的分子机制提供借鉴；同时也为通过分子改造获得高转糖苷活性的糖苷酶奠定了理论基础，具有重大的理论意义及实际应用前景。

低聚半乳糖(GOS)是人类肠道益生菌的增殖因子，能促进双歧杆菌的生长，改善肠道的微生态平衡，广泛应用在食品、医药、饲料等行业，具有诱人的开发应用前景。本项目选取亮白曲霉β-半乳糖苷酶为试验材料，较顺利地完成了研究计划，取得以下结果：.1、运用生物信息学知识对β-半乳糖苷酶的3D结构、催化及转糖苷活性相关位点进行预测，选择了6个可能与转糖苷活性相关的键氨基酸位点：S219，D239，S240，Y241，F245，E785。.2、以优化的发酵培养基代替传统诱导培养基，并利用深孔板培养创建了一种简便、稳定、高通量的筛选方法。.3、采用定点饱和突变方法构建了单点及双点组合毕赤酵母饱和突变体库。实验结果分析表明，6个氨基酸位点的突变子可分为三类：第一类为保守性位点D239与Y241，这两个位点突变后，所有突变体的水解活力和转糖苷活力都大幅下降；第二类为次要位点S240，该位点突变为其他氨基酸后对GOS产量的影响不明显；第三类为主要位点S219、F245 和E785，这些位点突变后，各突变体的GOS产量变化幅度很大。选定这三个主要位点，进行两两组合突变，发现S219/E785双点组合突变能够提高GOS产量，而F245/ E785双点突变体与S219/F245双点突变体均导致GOS产量降低。.4、从多个突变体库中筛选到11个转糖苷活力较高的突变体，与野生型酶相比，这些突变体催化生成GOS的速率都较快，而且高聚合度的GOS（四糖以上）产量明显增加，最高GOS产量和GOS转化率也都有提高。其中S219G/E785V突变体其GOS生成速率较野生酶提高了211%。.5、酶学性质研究表明这些突变体最适温度与最适pH没有发生明显改变，但以oNPG为底物的比活力、动力学参数Km、kcat及kcat/Km都发生较明显变化，以 S219G/E785V 为例，其比活力较野生酶提高45.3%，Km值由野生酶的1.63变为1.52，kcat由90.7变为127.5，kcat/Km 由55.6变为83.9。.6、从蛋白质结构层面揭示了D239、S240、Y241、S219、F245及E785对β-半乳糖苷酶LACB转糖苷反应的影响。.7、本课题参加人员共6名，培养硕士研究生2名。获得1项中国发明专利授权，新申请中国发明专利2项。发表SCI收录论文2篇，中文核心期刊论文2篇。