APOBEC3B与hnRNP K在肝细胞肝癌发病机制中作用的研究

本课题旨在原有工作基础上，研究配对肝癌和相应癌旁肝组织中APOBEC3B(A3B)和hnRNP K的mRNA和蛋白表达水平及两者表达的相关性；通过研究A3B不同表达水平的肝癌组织或转染A3B前后肝细胞系中hnRNP K的mRNA表达变化及其序列中的G→A突变特征，分析A3B的胞嘧啶脱氨酶活性对体内外细胞中hnRNP K核酸表达及序列的影响，试图解释体内hnRNP K序列突变的原因，以期进一步探索A3B和hnRNP K的相互作用及其在肝细胞肝癌发生和发展机制中的可能作用；通过构建A3B脱氨酶不同活性位点的突变体表达质粒和hnRNP K不同结构域片段的表达质粒进行细胞转染、免疫共沉淀和蛋白印迹等实验，深入研究A3B和hnRNP K蛋白之间相互作用的具体区域以及A3B脱氨酶活性位点的突变对其相互作用的影响，为筛选新的药物靶分子提供理论依据。

本课题在原有工作基础上，收集了34例肝细胞肝癌标本并对其A3B和hnRNP K的表达水平及相关性做了进一步研究，结果表明，A3B在肝癌组织中的表达均高于癌旁肝组织，进一步证实了我们以前的研究结果，A3B高表达可能参与了HCC的发病机制。而hnRNP K在两种组织中的表达并无显著差异，A3B和hnRNP K的表达无显著相关性，提示我们hnRNP K可能不是通过其表达水平的改变参与HCC的发病机制。 在我们的肝癌标本中未检测到hnRNP K mRNA序列存在G274A突变，肝癌细胞系在过表达A3B后也不会引起该位点发生G274A突变。这与我们以前的预测相反，A3B并未引起hnRNP K mRNA序列上该位点的碱基突变。我们构建了三个A3B酶活性突变体质粒，用以研究A3B脱氨酶活性对A3B抗HBV功能及其与hnRNP K蛋白结合的影响。结果显示，A3B脱氨酶活性的缺失并不影响其对HBsAg和HBeAg的抑制作用；A3B脱氨酶活性突变体质粒表达蛋白也能与hnRNP K蛋白结合，但C100S位点突变可使两者的结合作用减弱，这为以后设计特异性的靶向药物提供了理论依据。随后我们探索了与A3B相结合的hnRNP K的结构域，发现hnRNP K的K同源域（KH1、KH2、KH3）及KI结构域均能与A3B蛋白结合，这为今后筛选新的药物靶分子提供了理论依据。在研究过程中我们还对APOBEC3家族中的另一蛋白酶成员——A3DE的抗病毒功能进行了初步研究，发现A3DE对细胞内HBV的core DNA合成并无抑制作用，但是却能明显抑制细胞上清中HBsAg和HBeAg水平，提示A3DE也参与了机体抗HBV功能。因此，进一步研究A3DE抗HBV的作用机制，以及它与A3B或该家族其他蛋白酶成员之间在抗病毒或抗肿瘤机制中的相互关系为今后的研究提供了新思路。