顿挫型 RNA 阳性 HBV 隐匿性感染状态肝细胞癌发生相关基因的筛选和确定

In the previous study, a simplified assay for differently recognition of 3' end of HBV RNAs has been successfully established based on the supportting from interenational scientific fundation and NSFC. The application study of the assay in the HCC indicated the presence of larg amount of special HBV infection stage with HBV truncated RNA positive in HBsAg negative HCC patients. In addition, the high frequent (over 60%) LOH has been selected via Affymetrix SNP 6.0 array. In the proposed project, we planned to continuously select and confirm genes related with the carcinogenesis of this HBsAg negative but HBV truncated RNA positive HCC, via Pyrosequencing technology, DNA cloning, real-time PCR, immunohistochemistry, western-blotting and cell culture. This will provide a basic reference for the high risk individual selection,early diagnosis and personalized therapy for this "special" HBV infection HCC for the new HCC prevention and treatment stratagy.

在国际合作基金和国科金的资助下，应用我们前期研究建立的区分和检测HBV RNA 3'端结构的方法研究发现，一种以HBV 顿挫型RNA（trRNA）为唯一病毒标志物的"特殊"HBV感染状态大量存在于 HBsAg阴性肝癌（HCC）中，并通过Affymetrix SNP 6.0 基因芯片初步筛选出了全基因组中这种"特殊"HBV 感染状态 HCC特有的中、高频率（60%以上）发生染色体扩增和缺失的片段及其所包含的基因。本课题拟进一步通过Pyrosequencing技术、亚克隆技术、定量PCR 、免疫组化、蛋白质印迹及体外细胞功能实验进一步筛选和验证，确定这种trRNA阳性HBsAg 阴性特殊HBV 感染状态HCC发生所特有的相关基因，阐明这种"特殊"感染状态HCC的分子遗传学特点。为新的HCC 防治策略中针对这种"特殊"HBV 感染状态 HCC 的高危人群筛选、早期诊断和个体化诊疗奠定理论基础。

HBsAg阴性、trRNA阳性的特殊感染状态的HCC的分子遗传学特征可能有别于HBsAg阳性HCC，可能是HBsAg阴性的HCC发生的病理基础。我们通过外显子测序结果及扩大样本量进行研究，并且通过Affymetrix SNP6.0检测筛选出HECA, SVEP1, HOXA9，CD147, GPC3，CSMD1等15个高频率外显子基因突变及NRG1、DLC1、KCNU1、CSMD3等107个存在基因杂合性缺失的多个基因，通过相关分子生物信息学软件及查阅文献分析筛选出可能与特殊感染状态的HCC发生发展相关的基因及调控其的miRNA，并完成Realtime PCR、免疫组织化学、蛋白印迹及和体外细胞功能实验研究。结果显示，调控GPC3的miR-202，HOXA9可能发挥抑癌基因的作用，而miR-96、调控CSMD1的miR-10b 、HECA、GPC3、CSMD1可能发挥癌基因的作用，其在HBsAg阳性及特殊感染状态的HCC患者中无明显差异。这些关键基因与miRNA的发现为这种“特殊”感染状态的HCC高危易感人群筛选和早期预防、早期诊断和进一步的个体化诊疗奠定了理论基础。