β-半乳糖苷酶转糖苷活性的功能进化与调控机制研究

Galactooligosaccharide as the new food additive, owns unique functionality. However, the yield in galactooligosaccharide is limited by the synthetic capability of biocatalyst β-galactosdase. The low transgalactosylation activity and the reverse-hydrolysis reaction associated with transgalactosylation are the common disadvantage for production galactooligosaccharide，which limited by the synthesis efficiency. The objects of this study are the function optimization of transgalactosylation activity, based on the evolution divergences modification and the research on the regulation mechanism of bidirectional catalytic reaction. According to the differences of the capability on galactooligosaccharide production, the glycosidase will be classified in this study. The amino acid sites, where the evolution divergences occur, will be research using the family as the unit for evolution analysis. The amino acids in the TIM domain are the targets for molecular evolution. The optimization mutants could gain through bidirectional screening. The regulation mechanism of bidirectional catalytic reaction could be studied based on the result of molecular modification and transient analysis. The research result of this study could direct the development of new biocatalyst using for galactooligosaccharide production.

低聚半乳糖以其特有的功能性，成为新型食品添加剂。但其生产量却一直受到生物催化剂β-半乳糖苷酶合成能力的制约。本项研究针对β-半乳糖苷酶转糖苷活性低、存在逆向水解催化，导致低聚半乳糖合效率受限这一共性瓶颈问题，拟通过针对功能差异位点的分子改造优化催化剂性能，并对其双向反应的分子调控机制进行探讨。研究拟依据低聚半乳糖合成能力差异，对现有糖苷酶数据资源进行分类汇总。以具有共性催化特性的家族为单位，通过进化历程分析探索其功能分歧产生的氨基酸位点。针对糖苷酶TIM保守催化结构域内的功能分歧位点进行体外体外改造，结合"转糖苷-水解"双向催化活性筛选，以期达到优化低聚糖合成能力的目标。在功能分歧位点改造与双向筛选结果基础上，对反应过渡态进行分析，探索β-半乳糖苷酶低聚半乳糖合成与水解反应的分子调控机制，为开发新型低聚半乳糖生物催化剂提供理论指导。

低聚半乳糖是一种重要的功能性低聚糖，其产量一直受限于生物催化剂β-半乳糖苷酶的合成能力。本项目针对β-半乳糖苷酶转糖苷活性低、存在逆向水解这一限制低聚半乳糖合成效率的共性瓶颈问题，以GH42家族嗜热脂肪芽胞杆菌来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB为模式酶，采用分子动力学模拟与酶家族功能进化相结合的研究策略，对β-半乳糖苷酶TIM保守结构域内的功能氨基酸位点进行定位。通过位点突变体构建及催化特性分析，分别确认了具有亲核催化氨基酸作用、底物结合作用及与环境适应性进化相关的功能位点。并分别阐述了主要功能位点对β-半乳糖苷酶催化活性的分子调控机制；获得了转糖苷活性提高的单点突变体，及兼具抑制水解活性与转糖活性提高的双点突变体。在完成预定研究目标基础上，本项目还针对试验过程中遇到的两个应用性问题，进行了研究拓展。项目主要研究内容与重要结果概括如下：.1) 结合分子动力学模拟与酶家族功能进化，建立了高效定位功能氨基酸位点的研究策略，为现有基于理性与半理性设计的分子改造方法提供了参考与补充；.2) 研究了家族内高度保守位点（Glu303）突变对酶活性的影响，揭示了其亲核催化氨基酸作用，及对转糖苷活性的调控功能规律；.3）系统分析了GH42家族保守氨基酸位点的分化与变异规律，发现了与环境适应性有关的进化分歧位点（Ile42），并阐述了其对酶热稳定性与催化活性的分子调控机制。.4）通过对功能氨基酸位点间累积突变体性质的研究发现，保守位点的协同突变以导致催化效率降低的负向进化为主；通过缩短结合位点氨基酸侧链长度，扩大活性口袋空间，能够获得具有双重功能优化的突变体酶。.本项目从微观分子作用与宏观进化相结合的角度，深入揭示了β-半乳糖苷酶催化活性的分子调控机制及功能氨基酸位点的进化规律。不仅为酶的功能研究提供了方法参考，更为β-半乳糖苷酶的功能改造及对低聚半乳糖的合成调控提供了科学依据。