黄酮苷相关酶在亳菊加工炮制中的作用及其对亳菊品质的影响研究

When the chrysanthemum in Bozhou processing technology is changed it undergoes a rapid change in flavonoids. Through the preliminary study, we speculated that heating activates the activity of flavonoid glycoside related enzymes, which act on flavonoid glycosides and cause them hydrolyzed. At present, heating drying is the major means in origin. But the influence on the traditional medical effect is not definitive. Hence, it is necessary to research the effect on chemical composition, pharmacodynamics and pharmacokinetics about chrysanthemum in Bozhou by changing the processing technology. The effect on chrysanthemum in Bozhou quality, caused by the change resulted from taking different processing technologies in the activity of the flavonoid glycoside related enzymes, has not been studied intensively. The main content of this study is to control the change of flavonoids during the processing by means of regulating the related enzymes' activities. It can be cornerstone of the modern processing technology, provide the basis for the comprehensive evaluation of the quality and clinical use of chrysanthemum in Bozhou. And make more contribution to traditional Chinese medicine processing modernization.

亳菊加工炮制方法的改变使其黄酮类成分发生明显的变化，初步研究推测其原因可能是加热激活了亳菊黄酮苷相关酶的活性，由黄酮苷相关酶作用于黄酮苷类成分，引起黄酮苷类化合物的分解。目前产地以加热干燥为主要手段的加工炮制方法对亳菊传统药效产生的影响尚不确定，因此开展对亳菊加工方法的改变对其化学成分、药效及药物代谢动力学进行研究十分必要。黄酮苷相关酶的活性产生变化的主要原因是亳菊加工炮制方法的改变，而酶的活性的变化对亳菊品质的影响尚未深入研究。本研究通过找到亳菊中分解黄酮苷类化合物的相关酶，调节黄酮苷相关酶的活性，控制炮制加工中亳菊黄酮类有效部位的变化为主要研究内容，为亳菊现代炮制加工提供研究基础，为亳菊质量的全面评价和指导临床使用提供依据，为中药炮制加工现代化做出更大贡献。

本研究对β-D-葡萄糖苷酶在亳菊加工炮制过程中对黄酮类成分的影响进行研究，阐明亳菊加工机理，为亳菊炮制加工方法的优选提供理论依据。本研究建立HPLC测定亳菊不同加工炮制样品中两种苯丙素类（绿原酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸）和六种黄酮类成分（木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷、金合欢素7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素）含量的方法，采用SIMCA-P软件对亳菊不同加工炮制样品中两种苯丙素类和六种黄酮类成分的含量进行综合分析，可应用于亳菊加工炮制过程中各成分变化规律的研究。在干燥加工过程中对亳菊分类影响最大的成分依次是3,5-二咖啡酰基奎宁酸，绿原酸和金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷，而木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷贡献度最小。产地大规模使用的烘干法加工仍然无法替代传统阴干方式，但是传统阴干法加工亳菊已经不能满足现代生产需求，高温杀青后烘干的模式成为可替代的加工方法，由于蒸汽杀青后干燥可能会降低亳菊中的挥发性成分，微波杀青后干燥可能成为产地加工亳菊的首选择。对来源于亳菊中β-D-葡萄糖苷酶进行分离纯化，β-D-葡萄糖苷酶经过SDS-PAGE测得其分子量约为48kD，可能为单体蛋白或者同源二聚体，有待于进一步实验验证。β-D-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃，最适pH为5.0，同时该酶对pNPG具有较强的亲和力。实验以亳菊阴干总黄酮为底物，在50℃水浴中与纯化的亳菊β-D-葡萄糖苷酶反应，总黄酮中黄酮苷成分水解生成相应黄酮苷元，说明亳菊黄酮苷的体外水解与体内水解具有一致性，表明亳菊β-D-葡萄糖苷酶是亳菊炮制加工过程中黄酮苷成分水解的主要因素，验证了实验假说。课题同时亳菊总黄酮进行提取富集工艺研究。在明确总黄酮抗心肌缺血活性有效的基础上，对亳菊中主要的三种黄酮苷及其对应苷元进行其对心肌细胞H9c2保护作用的筛选，结果显示木犀草素和金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷具有显著的促进心肌细胞H9c2增殖的作用，表明金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷和木犀草素对心肌细胞有显著的保护作用，且金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷的作用优于木犀草素。通过检测三种不同工艺处理亳菊总黄酮在大鼠体内的药代动力学特征发现，总黄酮中木犀草素药代动力学行为发生改变。