线粒体DNA损伤介导的脊髓小胶质细胞cGAS-STING炎症通路在睡眠紊乱诱发术后慢性疼痛中的作用及机制研究

Chronic postoperative chronic pain (CPSP) seriously affects the quality of patients’ life. Clinical studies have shown that perioperative sleep disorders have a strong correlation with postoperative chronic pain. Our preliminary studies and available literature suggested that spinal microglia-mediated neuroinflammation is involved in the pathogenesis of CPSP. Perioperative sleep disorders cause microglial mitochondrial DNA(mtDNA) oxidative damage, changing microglial cells into ‘priming’ state; surgical stress further aggravate mtDNA damage, releasing the damaged mtDNA into cytoplasm. Recognition by cGAS triggers the STING pathway-mediated inflammatory response and activates the NLRP3 inflammasome, resulting the development of CPSP. STING as the central part of this inflammatory pathway, the downstream effects mediated by autocrine motility factor receptor (AMFR) and RING finger protein 5 (RNF5) depend on the poly-ubiquitination regulation of STING. This study intends to investigate the microglial mtDNA damage and cGAS-STING signal in the model of part sleep deprivation-induced chronic pain after incision in mice and its spinal cord microglia cultured in vitro, to explore the specific mechanism and regulation of this pathway. The results will provide a new theoretical basis for clinical prevention and treatment of chronic pain induced by sleep disorders.

术后慢性疼痛（CPSP）严重影响患者生活质量，临床研究表明围术期睡眠紊乱与术后慢性疼痛的发生具有强相关性。我们的前期研究和现有文献提示，脊髓小胶质细胞介导的神经炎症反应参与CPSP的发生。围术期睡眠紊乱引起小胶质细胞线粒体DNA（mtDNA）氧化损伤，使小胶质细胞处于敏化状态；手术应激进一步加重mtDNA损伤，并使其逸出至胞质，被cGAS识别后触发STING通路介导的炎症反应，激活NLRP3炎症小体，导致CPSP的发生。STING作为该炎症通路的中心环节，其介导的下游效应有赖于AMFR与RNF5对STING的多聚泛素化调节。本项目以部分睡眠剥夺诱发切口术后慢性疼痛小鼠为动物模型，以脊髓分离培养的小胶质细胞为细胞模型，探讨小胶质细胞mtDNA损伤介导的cGAS-STING炎症通路在睡眠紊乱诱发术后慢性疼痛中的作用及调节机制，为临床防治睡眠紊乱诱发的术后慢性疼痛提供理论基础。

世界上每年有多达3亿例外科手术，约10%～50%的手术患者确诊持续术后疼痛，严重影响手术患者的生活质量。一项大型荟萃分析研究发现睡眠困难与术后疼痛控制不良高度相关，其具体机制尚不明确。小胶质细胞是中枢神经系统中主要的免疫细胞。对快动眼睡眠障碍患者的研究表明，其小胶质细胞显著活化，并介导严重的神经炎症。有研究提示碎片化和功能异常的小胶质细胞线粒体可以引起中枢神经系统炎症反应和神经细胞的死亡。睡眠剥夺后的氧化应激会导致线粒体损伤，线粒体DNA（mtDNA）片段释放到细胞质中，通过与模式识别受体的结合参与炎症反应。cGAS在小胶质细胞中高表达，是小胶质细胞识别胞质DNA的主要受体，mtDNA进入细胞质后通过STING信号通路依赖方式调节小胶质细胞的活化与增殖，激活后的小胶质细胞参与神经炎症反应，进而参与持续术后疼痛。本研究中，我们通过干预脊髓中枢氧化应激水平探讨睡眠剥夺致持续术后疼痛的作用机制。1.小鼠在连续48小时睡眠剥夺后出现机械缩足阈值和热缩足阈值的下降；与单独足底切口相比，睡眠剥夺后行足底切口的小鼠表现为疼痛行为学下降程度加重且时间延长；2.术后第1d及第7d小鼠检测脊髓ROS、iNOS、DNA损伤指标PARP1及BRCC36、mtDNA损伤指标TFAM、cGAS-STING通路及NLRP3相关蛋白表达，结果显示睡眠剥夺复合切口手术组小鼠脊髓中上述指标表达较对照组、切口手术组及睡眠剥夺组均显著升高；免疫荧光染色结果显示术后第7天mtDNA损伤标志物表达及小胶质细胞活化在睡眠剥夺复合切口手术后显著升高；3.在睡眠剥夺及切口手术前预先鞘内注射ROS清除剂PBN，显著改善小鼠切口术后痛行为学，术后第7d检测小鼠脊髓ROS、iNOS、DNA损伤指标PARP1及BRCC36、mtDNA损伤指标TFAM、cGAS-STING通路及NLRP3相关蛋白表达，结果显示PBN干预组小鼠脊髓中上述指标表达较溶剂对照组均显著降低；免疫荧光染色结果显示DNA损伤标志物表达及小胶质细胞活化在PBN干预后显著减少；4.在睡眠剥夺及切口手术前预先腹腔注射右美托咪定，机械缩足阈值和热缩足阈值均显著提高，提示右美托咪定有效改善睡眠剥夺切口小鼠术后痛行为学。