跨越式滚环等温扩增机理及其检测食品病原体方法的研究

The microbial food poisoning ranks the first place among the factors affecting food safety in China. The traditional method for the detection of food borne pathogen is inconvenience and time-consuming, whereas the method of nucleic acid amplification is rapid and simple. Saltatory rolling circle amplification (SRCA) is a linear DNA isothermal amplification performed by Bst DNA polymerase. This reaction system is simple and does not need probe and ligase to cyclize the linear DNA template, comparing to the other amplification methods such as LAMP and RCA. However, the amplification mechanism is unknown. The non-specific amplification of this amplification system restricts its application to the detection of pathogen. Therefore, it is urgent to ascertain the mechanism of amplification to solve the non-specific amplification, and lay the foundation for its development and application. This project intends to clarify the process and the principle of "Saltatory rolling circle amplification" by the sequence analysis and the identification of constituent of the amplification product. It may reveal the new features of Bst DNA polymerase and explain the non-specific amplification in LAMP and RCA. We will derive and establish a reaction kinetics mathematical model and test it. We will also investigate the principles of primer design based on the amplification mechanism, optimize the amplification reaction system and finally established an efficient, sensitive, low-cost detection method of food borne pathogens. This project will elucidate the molecular mechanism of amplification reaction, providing a theoretical basis for predicting the amplification reaction and quantitative detection, and laying the foundation for its application in the future.

在影响我国食品安全的因素中微生物性食物中毒排名第一，食品病原菌传统检测方法繁琐、耗时长，而核酸扩增技术可快速检出病原菌。"跨越式滚环等温扩增"即由Bst DNA聚合酶启动的线性DNA新型等温扩增反应，与LAMP和RCA等温扩增反应相比，反应体系简单，不需要探针和连接酶环化，然而其扩增机理不明，且存在非特异性扩增，制约其在检测方面应用。因此，急需探明其扩增机理，解决非特异性扩增问题，为开发应用奠定基础。本项目拟通过对扩增产物成分和序列分析，阐明"跨越式滚环等温扩增"的过程和原理，揭示Bst DNA聚合酶的新特性，并可解释LAMP和RCA非特异扩增现象；推导和建立反应动力学数学模型，并对模型进行验证；依据其扩增机理，研究引物设计原则，优化扩增反应体系，建立高效灵敏、成本低廉、结果判断直观的食品病原体检测方法。本项目将阐明其扩增反应分子机制，为预测反应和定量检测提供理论依据，为其应用奠定基础。

在影响我国食品安全的因素中微生物性食物中毒排名第一，食品病原菌传统检测方法繁琐、耗时长，而核酸扩增技术可快速检出病原菌。“跨越式滚环等温扩增”即由BstDNA 聚合酶启动的线性DNA 新型等温扩增反应，与LAMP 和RCA 等温扩增反应相比，简便、成本低廉，不需要探针和连接酶环化，然而其扩增机理不明，制约其在检测方面应用。因此，急需探明其扩增机理，为开发应用奠定基础。本项目通过对扩增产物的序列分析，阐明“跨越式滚环等温扩增”的过程和原理，揭示Bst DNA 聚合酶的新特性，同时，从理论上解释Bst 酶启动的扩增反应产生非特异性扩增的原因。依据其扩增机理，研究引物设计原则，建立高效灵敏、成本低廉、结果判断直观的食品病原体检测方法，为其应用奠定基础。. 目的序列的扩增机理为：目的DNA模板及其特异性引物在一定恒定温度下进行的一种类似于指数滚环扩增的扩增方式，其扩增产物由串联重复序列构成，串联重复序列由三段相邻的序列构成，包括特异性引物间目的DNA序列（核心序列）和核心序列在基因组中所在位点的两侧序列）。引物自身扩增的机制为：Bst DNA 聚合酶以上游引物P1 为模板合成其互补链RcP1，并和P1 形成双链DNA; 之后，Bst DNA 聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1 的3'末端沿5'→3'方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸( dNMP) m 序列，即DNA 的合成反应跨越了RcP1 与下游引物P2 之间的缺口; 然后，以下游引物P2 为模板形成互补序列( RcP2) ; 接着，Bst DNA 聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2 的3'末端，形成( dNMP) n 序列． 继而，Bst DNA 聚合酶以RcP1为模板，继续催化聚合反应合成互补新链，并通过其链置换酶活性替换P1; 如此往复，形成［P1-( dNMP) m-RcP2-( dNMP) n-…］序列．. 利用扩增机理，建立了跨越式滚环核酸等温扩增的反应体系。确定了引物的设计原则，避免了发生引物自身扩增，提高了检测结果的特异性。针对沙门氏菌、志贺氏菌、克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌和酸土脂环酸芽孢杆菌的 特异性基因，设计引物，优化反应体系，建立了跨越式滚环核酸等温扩增技术检测以上食品病原菌和腐败菌的方法，实现了结果判断的可视化。