钙调蛋白激酶Ⅱ在镉致成骨细胞内质网应激凋亡中的作用及其调控机制

Cadmium (Cd), an industrial toxic heavy metal, frequently pollutes environment. Cd is detrimental to many organs such as livers, kidney and skeletons. Our prior study showed that Cd induces apoptosis by increasing the cytoplasmic calcium levels in osteoblasts. CaMKⅡ is involved in apoptosis induced by Cd in neurons. How Cd causes cytoplasmic calcium overloads remains unclear; whether CaMKⅡ is involved in OB apoptosis through ER stress pathway is not known. In this research project, we will use flow cytometry and live cell Imaging system to quantify the concentration and distribution of cytoplasmic Ca2+; use Western blot and real-time quantitative PCR to analyze the expression of ER stress-related proteins, ER stress mediated apoptosis-related proteins, Bcl-2 family proteins, MAPKs signaling pathway, the activation of caspase-12; and use immunofluorescence and flow cytometry to detect the level of cell apoptosis. Our study will clarify the role of CaMKⅡ on Cd-induced ER stress and apoptosis in OB and elucidate the mechanisms by which CaMKⅡaffects the key ER stress-related kinase. We anticipate that our study will greatly advance basic science knowledge in Cd-induced OB cytotoxicity, and provide new insights into prevention and treatment of bone injury induced by Cd.

镉是一种有毒的工业重金属污染物，它会造成多种组织器官损伤，包括肝脏、肾脏和骨骼。我们的前期工作显示镉会通过胞浆钙超载诱导成骨细胞凋亡。有研究表明钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）能参与镉诱导的神经细胞凋亡。然而镉如何导致成骨细胞钙稳态失衡，以及镉是否通过激活CaMKⅡ诱导成骨细胞内质网应激凋亡仍不清楚。本项目将运用流式细胞术和活细胞工作站检测胞浆内钙离子浓度及分布；运用免疫印迹和荧光定量PCR检测内质网应激相关蛋白、内质网应激凋亡相关蛋白、Bcl-2家族蛋白、MAPKs信号通路蛋白的转录和表达；运用免疫荧光和流式细胞术检测细胞凋亡水平。目的是揭示CaMKⅡ在镉诱导成骨细胞凋亡过程中的作用，阐明CaMKII如何调控内质网应激过程中关键性的酶从而诱导成骨细胞凋亡，从而从细胞和分子水平揭示镉致骨损伤的信号转导机制，为临床预防治疗镉致骨骼损伤提供新思路。

镉作为广泛存在的重金属污染物，一般以镉离子形式通过钙离子泵、受体等通道进入细胞，它会影响细胞内钙离子分布。胞内钙离子的浓度改变会引发CaMKⅡ表达水平改变以及内质网应激反应。然而，关于CaMKⅡ在成骨细胞凋亡和内质网应激中的作用的报道较少。因此，本研究通过建立体外大鼠原代成骨细胞镉中毒模型，探讨镉对成骨细胞内质网应激和CaMKⅡ蛋白变化水平的影响以及CaMKⅡ在内质网应激介导凋亡中的作用。.以不同浓度的醋酸镉处理原代成骨细胞或醋酸镉处理成骨细胞不同时间，免疫印迹法检测BIP、ATF4、CHOP等蛋白表达；镉、2-APB单独或共处理，RTCA检测细胞指数变化，免疫印迹法检测cleaved-caspse12、cleaved-caspase3等蛋白表达，流式细胞术测定凋亡率、Hoechest33258染色观察细胞核形变来研究钙离子浓度改变对CaMKⅡ表达的影响；镉、KN93单独或共处理成骨细胞，免疫印迹法检测BiP、ATF4、CHOP等蛋白表达量、流式细胞术测定凋亡率、Hoechest33258染色观察细胞核形变来研究CaMKⅡ对内质网应激介导凋亡的影响，以及对MAPK信号通路的影响。.结果表明：①2-APB及与镉共处理钙离子浓度下降；镉处理能显著提高BiP、ATF4、CHOP三个蛋白的表达水平；②镉处理会引起成骨细胞CaMKⅡ磷酸化水平的升高。RTCA结果显示KN93能够有效缓解Cd引起的细胞损伤。镉处理引起BiP蛋白表达水平的升高， KN93与镉共处理未恢复Cd处理引起的Bip表达升高，反而有叠加效果。镉处理引起ATF4与CHOP蛋白表达水平的升高，而KN93与Cd共处理能有效地缓解两种UPR蛋白表达的升高。③镉处理使得caspase 12和caspse 3的活化水平都极显著升高。2-APB（或KN93）与镉共处理能极显著降低Cd引起的 cleaved-caspase 12和caspase 3蛋白活化水平的升高。2-APB和KN93能极显著降低镉处理引起的细胞凋亡率上升。Hoechst 33258荧光染色可见镉暴露的成骨细胞出现细胞核染色质浓染、核碎片等，能缓解Cd引起的细胞核形变。④镉处理会引起Bax与Bcl-2比值明显上升，而共处理组能极显著下降Bax与Bcl-2比值。同时，镉处理组MAPK三种蛋白的磷酸化水平升高，镉与KN93联合处理组磷酸化水平降低。