基于动态高压微射流和分子修饰的去折叠态胰蛋白酶热稳定性及其相关机理研究

前期实验研究了动态高压微射流（DHPM）手段对胰蛋白酶的酶学性质与构象变化的影响，结果表明胰蛋白酶的反应（热、pH）稳定性获得极大提高是与DHPM诱导的去折叠化（unfolding）分子构象有关。本课题拟采用圆二色谱、FT-IR光谱、核磁共振波谱、荧光光谱和巯基含量测定等手段分析去折叠态胰蛋白酶的构象变化，探讨其折叠动力学，揭示其酶学性质改变和去折叠态构象变化之间的关系。在此基础上，采用琥珀酰亚胺碳酸酯活化单甲氧基聚乙二醇（mPEG-SC）为分子补丁修饰去折叠态胰蛋白酶，使其分子表面的赖氨酸与mPEG-SC共价连接生成PEG-unfolded胰蛋白酶聚合物，阻止其分子构象进行再折叠或聚集，将其固定在热力学平衡的过渡态构象中而发挥较好的热稳定性，并揭示分子修饰DHPM诱导的去折叠态胰蛋白酶的热稳定性机理，为酶的修饰与改性、蛋白质折叠等理论与应用的基础研究提供了一种新的技术方案与理论参考。

天然胰蛋白酶对热、强酸、强碱、有机溶剂等不够稳定，在工业应用中常常表现出活性下降甚至失活。采用固定化、化学和物理手段提高酶活性或改善其稳定性成为近年来酶学领域研究的热点问题。本项目前期工作表明，动态高压微射流（DHPM）诱导的去折叠态(unfolding)胰蛋白酶的反应（热、pH）稳定性获得极大提高，其空间构象也发生改变。本项目进一步分析了DHPM诱导的去折叠胰蛋白酶的构象变化。采用差示扫描量热法和圆二色谱分析天然和去折叠胰蛋白酶的结构，并通过软件进行三维空间结构的模拟和预测，直观地显示了酶的结构信息。结果表明去折叠胰蛋白酶热焓降低，二级结构单元百分含量发生变化，其结构更加松散。此外本项目还发现尿素对DHPM诱导的去折叠胰蛋白酶构象的影响比天然胰蛋白酶更为显著，并且不同尿素浓度下产生了不同构象的中间体，表现出“熔球态”模型特征。. 根据热力学假说，去折叠胰蛋白酶处于一种热动力学亚稳态，会自发进行再折叠或聚集使吉布斯自由能处于最低值，从而丧失其去折叠态的反应稳定性。本项目采用琥珀酰亚胺碳酸酯活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG-SC)作为分子补丁，修饰DHPM诱导的去折叠胰蛋白酶，阻止其分子构象再折叠或聚集，并进一步阐释DHPM与分子修饰后胰蛋白酶的热稳定性机理。在40、80、100、120、140MPa压力下处理胰蛋白酶并进行化学修饰，结果表明mPEG-SC修饰显著改善去折叠胰蛋白酶的储存稳定性和热稳定性，并抑制其构象再折叠，提高了处于过渡态的去折叠胰蛋白酶的稳定性。基于此，进一步详细研究了80MPa处理和mPEG-SC修饰的胰蛋白酶的性质和构象及其热稳定性机理。结果表明mPEG-SC修饰对去折叠胰蛋白酶的热稳定性和自溶性的改善效果明显好于天然胰蛋白酶，修饰后胰蛋白酶的米氏常数下降了约2倍，催化效率提高了3-4倍，修饰后去折叠胰蛋白酶的热稳定性机理在于其构象的变化，表现为更低的表面疏水性和更高的氢键结构。. 本项目克服了物理手段对酶的活性调节不可调控的缺陷，也克服了以往化学手段仅针对天然构象的酶分子进行修饰时需要解决蛋白质分子链的流动性的难题，通过物理手段诱导酶分子构象去折叠后再进行化学修饰，有针对性地对酶的分子构象层面的活性位点和配基进行修饰，为酶的修饰与改性、蛋白质折叠等理论与应用的基础研究提供了一种新的技术方案与理论参考。