氟诱导成骨细胞内质网应激致细胞凋亡机制研究

新疆是氟中毒流行区，该病对牙齿、骨骼、肝、肾等均有损害。氟骨症的损害主要为关节疼痛、僵直，骨骼变形，压迫神经等。前期研究已分别发现氟能引起成骨细胞的凋亡和内质网应激分子(BIP、XBP-1、CHOP)表达上调并发现氟能够引起成骨细胞凋亡，但对其机制尚未明了。针对过量氟的毒性作用，研究氟诱导成骨细胞内质网应激致细胞凋亡机制：采用细胞染氟模型，检测内质网应激三条分子通路（PERK、IRE1、ATF6）和线粒体凋亡途径相关分子（BCL-2、BAX、Caspase-9和Caspase-3）以及骨转化因子（ATF4,Runx2,Osterix，骨钙素，胶原I）的变化规律；通过对氟刺激前后及RNA干扰分子伴侣前后线粒体凋亡分子和骨转化因子变化特点探讨氟对成骨细胞氟过载病理机制的理解，以期为开拓氟骨症的干预新方法奠定重要的理论基础，为预防和治疗氟骨症提供新的策略和思路。

培养人成骨肉瘤细胞Saos-2建立染氟模型。按照染氟剂量将Saos-2分为0(对照组)、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80mg/L组。培养24h后收集细胞,实时荧光定量PCR测定成骨细胞成骨相关基因骨连接蛋白（ON）的表达。氧化应激状态分别测定超氧化物歧化酶（SOD)及丙二醛(MDA)的活性。用不同浓度的氟化钠干预24h后MTS法检测细胞存活率和流式细胞仪检测细胞凋亡百分率和线粒体膜电位，另外建立体外原代培养人成骨细胞染氟模型，用UPR信号通路、凋亡和骨分化三种功能芯片检测通路中相关基因表达的情况，并用Western blot检测蛋白表达。0.625、1.25、2.5、5mg/L组成骨肉瘤细胞ON表达分别低于对照组,但10、20mg/L组成骨肉瘤细胞ON mRNA表达明显高于对照组, 5～80mg/L组SOD的活性比对照组明显降低。10mg/L组MDA的活性与对照组比较明显升高。成骨细胞内ON表达水平与SOD活力呈负相关。以原代培养人成骨细胞体外染氟模型中，在氟化钠浓度为40 mg/L、80 mg/L时，细胞存活率分别为（77.97±2.54）%、（30.23±0.63）%，其它剂量组无意义。流式细胞仪检测，凋亡率分别为5 mg/L组4.8%，10 mg/L组13.8%，20mg/L组37.0%，40mg/L组58.9%，80 mg/L组63.2%。成骨细胞线粒体膜电位分别为10.0%、27.0%、28.9%、25.1%、28.8%、27.2%; 而空白对照为25.5%。PCR芯片检测发现：未折叠蛋白质反应方面1个基因表达下调，15个基因表达上调。免疫印迹结果显示BIP、ATF4、CHOP、IRE1、XBP1均呈现出不同程度的随氟剂量增加蛋白表达逐渐上调。高氟能抑制钙连接蛋白表达。对钙网蛋白表达影响较小。骨分化方面有32个基因表达上调，2个基因表达下调。涉及胶原、基质金属蛋白酶、整合素、骨形态发生蛋白、血管生长因子、肿瘤坏死因子等基因。凋亡方面，表达上调的有13个；表达下调的有15个。涉及线粒体和死亡受体途径。综合以上结果认为氟引起成骨细胞内质网应激的同时对骨转化基因的表达也产生影响。氟可通过影响成骨细胞内氧化应激状态和引起内质网应激而改变成骨分化。氟可通过PERK、IRE1和ATF6途径引起成骨细胞内质网应激，并且由此可以引起成骨细胞凋亡。