TLR4基因在百草枯中毒致肺损伤中对肺泡Ⅱ型上皮细胞的作用及作用机制研究

百草枯(PQ)是目前世界范围内使用量最大的除草剂，中毒者病死率极高。PQ中毒后主要引起急性肺损伤和肺间质纤维化而导致死亡。迄今PQ中毒机制尚未完全明了, 亦无有效拮抗药物。ATⅡ细胞功能受损和失去修复能力是PQ中毒致急性肺损伤及肺纤维化发展的重要原因。申请者在前期工作中发现，TLR4 表达与PQ中毒致ATⅡ增殖及分泌功能改变有明显相关性，并且可能不是通过目前已知的TLR4信号通路完成的。我们推测TLR4基因可能接受细胞内信号传导通路的上游信息，通过结合其它下游蛋白，调节细胞的某些重要生物学行为，行使其免疫基因的功能。本研究将利用分子细胞遗传学和生物信息学手段并构建转基因小鼠，进一步研究TLR4基因的生物学特性并阐明其在细胞信号传导途径中的位置，从而了解该基因的功能和调控机制。为阐明百草枯中毒性肺损伤发生的分子机制提供有价值的研究资料，并为百草枯中毒肺损伤的临床诊治提供新的思路和治疗药靶。

本研究首先证明TLR4基因在肺组织中有表达，并将其定位于细胞浆中。进一步的表达研究证实了TLR4基因在百草枯中毒肺组织中表达上调，且与急性肺损伤肺纤维化程度成明显正相关性。通过iTRAQ蛋白组学方法，我们发现了：1. 3种蛋白在百草枯中毒致肺损伤中，参与TLR4基因的上游调控和作为下游靶蛋白,分别为： Fasn （下游蛋白，具有保护作用），Apoe（上游调节蛋白，具有保护作用），Tnc (上游调节蛋白具有破坏性作用)2. 治疗相关蛋白：发现具有保护性作用的蛋白：Trf， Ahank2， Fasn ，Serpina1e， Apoe，Clu， Ttr，Apoc1；具有破坏性作用的蛋白：Ppp3r1， Set ， Cycs ， Tnc， Pzp；3. 反应性上调或下调的蛋白（可以作为PQ中毒的检测及预后指标）：Sec14l3，Cox5a，Bcam ， Car2 ，F2 ，Arf1 4.我们还发现氢分子在PQ 中毒肺损伤早期具有治疗作用，通过调控Bcam，Cycs，Cox5a，Apoc1，Fasn Fatty acid synthase，Ppp3r1，Pzp，Ahnak2等发挥作用，并且上述调控作用是通过TLR-4信号通路发挥作用。进一步的免疫组化、western-blot 及PCR结果验证了iTRAQ的结果。TLR4基因敲除小鼠在接触百草枯后急性肺损伤和肺纤维化明显减轻。本研究明确了百草枯中毒肺损伤过程中蛋白表达谱的变化规律以及TLR4基因和信号通路在此过程中的重要作用，为阐明百草枯中毒肺损伤的分子机制提供了重要的实验依据