食管癌中关键ncRNA细胞功能调控模块识别及其分子机制研究

China is the main country with a high incidence of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) in the world. At present, the molecular mechanisms underlying ESCC remain largely unknown, which severely limits the improvement of clinical diagnosis and treatment. Recently, based on series of research on important ESCC functional genes, our laboratory carried out a high-throughput deep sequencing on the whole transcriptome of ESCC, and found 821 significantly differentially expressed ncRNAs, which were significantly correlated with ESCC functional genes. Furthermore, these correlations showed evident modularity characteristics of cellular function and regulation and significant effects on ESCC prognosis, suggesting that further exploring these ncRNA-mediated cellular functional modules may not only allows revealing molecular mechanisms of ESCC, but also has clinical significance for patients with ESCC. Based on these results, the project plans to firstly construct ncRNA-mRNA differential co-expression network of ESCC. Secondly, based on the integration of differential expression, differential co-expression and network topology information, the project will design a novel algorithm for identifying ncRNA-mediated cellular functional modules at a system level by searching differential subnetwork. Thirdly, classifiers will be constructed for identifying key ncRNA-mediated cellular functional modules under the premise of accurate classification. Finally, through applying integrative biological experiments at the molecular and cellular level, the project will profoundly reveal the molecular mechanisms of ESCC from the special point of view about key ncRNA-mediated cellular functional modules.

我国是世界上最主要的食管癌高发国。目前，食管癌的分子机制尚不甚清楚，严重制约其临床诊治水平的提高。在以往食管癌重要功能基因系列研究基础上，近年我们实验室又开展了食管癌全转录组高通量深度测序，发现821个显著差异表达ncRNA，与食管癌功能基因密切相关。进一步分析显示，上述的这种相关性，有非常显著的细胞功能调控模块特征，而且还表现出十分明确的预后预警效果，预示以此为突破口继续探索，不但有助于揭示食管癌分子机制，而且有临床意义。为此，本项目拟首先构筑食管癌ncRNA-mRNA差异共表达网络；其次，设计新算法，整合差异表达、差异共表达和网络拓扑结构信息，搜索差异子网，从全系统水平识别食管癌ncRNA细胞功能调控模块；再次，构建分类器，识别精确分类意义下的关键ncRNA细胞功能调控模块；最后通过分子细胞水平综合性生物学实验加以验证，从关键ncRNA细胞功能调控模块独特角度，深刻揭示食管癌分子机制。

食管鳞癌（ESCC）是我国致死率第四的癌症，其5年生存率很差，从15%到25%不等。近年的研究表明长链非编码RNA (lncRNA)在ESCC中扮演广泛、重要的角色，一些lncRNA已被揭示为ESCC促癌或抑癌基因。尽管如此，我们对绝大多数lncRNA在ESCC中的功能知之甚少，且缺乏有效的研究方法和研究靶标。为了更好地理解lncRNA在ESCC中的作用，我们提出了一种基于差异共表达的子网识别算法，为在全基因组水平揭示lncRNA功能提供假设和靶点。首先，我们构建并比较了ESCC组织和癌旁正常组织中lncRNA和编码基因（PCG）的共表达网络，结合拓扑分析，发现与正常组织相比，基因之间的共表达关系在肿瘤组织中大量丢失，反映差异共表达可能体现ESCC发生机制；其次，构建lncRNA-PCG差异共表达网络（DCN），分析拓扑特征，发现DCN是无标度、小世界、模块化的网络；第三，基于DCN，提出整合差异表达和差异共表达的子网识别算法，在全基因组水平搜索以每个lncRNA为中心的差异子网，结合显著性检验，最终识别了107个显著的lncRNA相关差异子网。由于考虑了差异表达，这些差异子网具有很强的判别性。基于此，我们采用基于通路的分类器方法，推断子网表达谱，结合LASSO特征选择构建分类器，在训练集、测试集和验证集上均达到了几乎完美的分类效果，意味着这些差异子网在食管鳞癌发生发展中扮演重要角色，可作为潜在的子网标记。由于考虑了差异共表达，子网内的基因之间的连接关系能更好体现正常和ESCC组织间的变化关系。而且，这些子网在不同的数据集之间具有一致的差异共表达模式，显示出很强的鲁棒性。因此，这些lncRNA相关的差异子网为进一步研究lncRNA在ESCC发生发展中的功能提供了具有重要价值的假设和靶点。最后，我们通过Transwell细胞迁移实验、MTS细胞增殖实验，结合RNA-Seq测序，揭示并验证了核心模块中两个重要基因AL121899.1和ELMO2的抑癌作用。本文提出的差异子网识别方法被编译成一个R软件包“DCN”（https://github.com/weiliu123/DCN-package），研究者可使用该软件包方便地研究其他分子以及其它癌症类型。