模拟肌腱细胞形态和力学微环境诱导ASC成肌腱分化及机制探讨

组织微环境模拟是诱导干细胞特异分化的重要手段。脂肪干细胞（ASC）是肌腱组织工程的重要种子细胞，但缺乏相关基础研究。发育生物学研究显示Scleraxis及下游分子Tenomodulin在肌腱细胞分化和组织形成中起关键作用。基于我们前期工作提出如下假说：模拟肌腱细胞的狭长形态和单向力学刺激等物理微环境因素可以有效地将ASC诱导分化为肌腱细胞。为验证此假说，我们拟深入探讨：（1）细胞形态和力学刺激能否促进ASC表达肌腱细胞标志物分子并抑制其他方向的分化能力；（2）RhoA/ROCK通路和细胞骨架结构在ASC向肌腱细胞分化的作用；（3）采用Scleraxis驱动GFP小鼠和敲除小鼠观察该分子对成肌腱分化的调控作用；（4）采用Tenomodulin过表达和敲除小鼠探索该分子对成肌腱分化及肌腱细胞功能分子表达的调控作用。研究成果有助于阐明ASC向肌腱细胞诱导分化的机制和促进其在组织工程肌腱中的应用。

建立了以CD34为标志物富集、纯化小鼠ASC的可靠方法，以CD34为主分选出Lineage-:CD31-:CD45-:CD34+（简称CD34+）和Lineage-:CD31-:CD45-:CD34-（简称CD34-）两细胞亚群。CD34阳性细胞较阴性细胞具有更强的增殖、细胞集落形成能力（CFU-F）和多向分化能力，并具有更强的组织工程骨和软骨的形成能力和参与体内毛囊形成的能力。利用刻纹硅胶模控制细胞狭长形态，可使CD34+ASC表达肌腱细胞标志物包括tenomodulin、scleraxis、decorin、tenascin-C和I、Ⅲ、Ⅵ型胶原，而成脂、成软骨分化潜能下降，并展示了细胞骨架和RhoA/ROCK信号通路是主要的机制。在力学刺激方面，我们开展了体外三维模型静态力学刺激对ASC成肌腱分化的作用。将ASC接种在平行排列的PGA纤维上体外培养，给予静态牵拉力一组的ASC相较于无力学刺激组的细胞表达较高的Tenomodulin，而PPAR的表达则显著降低。同时静态牵拉力刺激下，细胞更趋平行狭长排列，胶原形成增多和平行排列，形成肌腱样组织，而无力学刺激组，细胞随机排列，胶原形成减少，并有脂肪样组织形成，形成的组织力学性能相对弱。在另一项研究中，将ASC接种在支架材料上，并回植入兔跟腱给予力学刺激，可见力学效应可以促进脂肪干细胞的成肌腱作用。 ..在二维研究的基础上，我们进一步在三维水平进一步验证科学假说，利用聚羟基乙酸（PGA）无序纤维和平行有序排列纤维接种CD34+ASC进行体外肌腱构建。实验结果显示细胞接种在平行有序排列的纤维上可以很好模拟二维环境中的细胞狭长形态，而在随机排列的无序纤维上，则可模拟二维中细胞铺张状态。经过体外8周构建，有序排列组的组织可见有规则的纵向排列细胞和胶原纤维，有更多的细胞外基质沉积。另外有序排列组构建出的肌腱的TNMD表达量较材料无序排列组高。说明平行有序排列的PGA材料能控制所黏附细胞呈狭长细胞形态，并能有效促进CD34+ASC和PGA形成的细胞材料复合物向肌腱组织分化。通过本项目的研究，基本完成了预定的目标证实了所提出的科学假说：模拟肌腱细胞狭长形态和力学刺激微环境可将CD34+ASC向肌腱细胞诱导分化。通过本项目资助，还完成肌腱与组织工程相关研究论文5项。本研究共发表SCI论文12篇，参编国外专著5本，国际会议应邀发言9