线粒体通透转换孔mPTP的分子身份及其与心肌细胞死亡的关系

线粒体通透转换孔（mPTP）是位于线粒体内膜上的一些蛋白质分子在某些病理情况下形成的蛋白孔道。mPTP一旦形成，线粒体基质肿胀，细胞色素c等丢失，线粒体失去正常功能，将导致细胞死亡。mPTP的形成与开放是众多心脑血管疾病发生发展过程中的共同环节，而某些肿瘤的发生与mPTP不能形成与开放、细胞不能及时死亡有关。因此，mPTP作为最有前途的药物靶点之一，是目前研究的热点领域，但mPTP的分子身份至今尚不清楚。本申请将以H9C2心肌细胞为实验主体，综合利用siRNA干扰及相关技术，对mPTP可能的构成基因进行逐一沉默和联合沉默，以细胞色素c释放作为mPTP开放与否及开放程度的指标，厘清构成mPTP的分子基础及它们在心肌细胞死亡中的作用。预期结果将导致潜在新药靶点的发现，为设计新奇有效的防治措施提供理论基础。因此本研究的预期成果具有广泛的科学意义与社会意义。

本研究主要针对线粒体通透转换孔（mPTP）的分子身份进行研究。mPTP是位于线粒体内膜上的一些蛋白质分子在某些病理情况下形成的蛋白孔道。mPTP 一旦形成，线粒体基质肿胀，细胞色素c 等丢失，线粒体失去正常功能，将导致细胞死亡。mPTP 的形成与开放是众多心脑血管疾病发生发展过程中的共同环节，其分子身份至今尚不清楚。. 在本研究中，我们首先利用序列比对结合种系发生分析，确立线粒体溶质转运体家族成员中存在序列及结构相似较高成员；然后利用RT-PCR技术检测SLCs成员的表达亚型并选择磷酸根运载体（SLC25A3）、腺嘌呤核苷转换体（SLC25A5）、ATP-Mg/Pi转运蛋白（SLC25A24和SLC25A25）作为研究对象；进一步通过RNAi干扰技术对初步筛选的线粒体溶质运载体家族成员进行逐一和联合干扰，用1.8mM/L钙离子和5µM Ionomycin刺激诱导mPTP开放，以细胞色素c释放作为mPTP开放指标。分别或联合干扰上述组分后，均能显著降低高钙诱导的细胞色素c的释放，显著降低高钙诱导的细胞死亡，并维持缺血再灌注损伤过程中线粒体膜电位的稳定，从而确立确立SLC25A3、SLC25A5、SLC25A24和SLC25A25是构成mPTP的重要组分。. 之后通过建立模拟缺血再灌注细胞模型，进一步印证上述组分参与缺血再灌注过程中mPTP的形成和开放，导致病理性Cyt c释放和细胞死亡。应用H9c2心肌细胞系建立缺血再灌注损伤细胞模型，然后采用RNAi干扰技术，单独或联合沉默SLC25A3、SLC25A5、SLC25A24和SLC25A25各mPTP组分相关基因，可有效抑制缺血再灌注损伤；而沉默Bax/Bak并不能有效防止H9c2细胞系的缺血再灌注损伤，提示mPTP损伤而非Bax/Bak通路，是缺血再灌注损伤时Cyt c病理性释放的主要通路。并且在实验中发现具有内在的抵抗缺血再灌注损伤能力的心肌细胞，其SLC25A3、SLC25A5、SLC25A24和SLC25A25表达水平下降。. 厘清mPTP分子身份为心血管病与肿瘤的机理研究及防治提供理论基础和框架，同时，为靶点特异性新药发现提供新的线索和思路。