BM-MSCs通过DCN调控急性肺损伤自噬关键蛋白Beclin-1与LC3B表达的信号转导机制研究

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) appear to exert an important therapeutic effect in acute lung injury (ALI). However, the underlying mechanism triggered by BM-MSCs is unclear up until now. Preliminary work from our research group has already confirmed that BM-MSCs can significantly up-regulate the levels of autophagy related genes-Beclin-1 and LC3B by paracrine decorin (DCN) and increase the level of autophagy in ALI, which significantly reduced the severity of ALI. Thus we speculate BM-MSCs can trigger the level of autophagy by DCN to reduce the severity of ALI. On the basis of established model of ALI mice and human pulmonary microvascular endothelial cells (HPMVECs), the BM-MSCs or conditioned medium of BM-MSCs were cultured and collected and then used siRNA interference to suppress or transfected with virus vector to up regulate the expression of DCN. Furthermore, according to the different levels of DCN expression in BM-MSCs, the effects of BM-MSCs on ALI and autophagy were investigated to explore the mechanism underlying this process at the molecular, cellular, and animal levels. It also provides the theoretical evidence for finding new therapeutic target point in ALI.

骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）在急性肺损伤（ALI）的修复中扮演重要角色，但其参与ALI损伤修复发生机制仍不甚明了。本课题组前期工作已证实：BM-MSCs通过旁分泌核心蛋白聚糖（DCN）上调ALI自噬相关关键基因Beclin-1与LC3B的水平，提高ALI自噬水平，从而显著减轻ALI的损伤严重程度。为此，我们提出假说：BM-MSCs可能通过分泌DCN正向调控ALI的自噬水平从而发挥其损伤修复的作用。为此，我们建立小鼠急性肺损伤及人肺微血管内皮细胞损伤模型；培养BM-MSCs并收集BM-MSCs的条件培养基；采用siRNA干涉抑制或慢病毒载体转染改变BM-MSCs中DCN的表达，进一步检测BM-MSCs中不同DCN水平对ALI自噬水平及损伤修复能力的变化，从分子、细胞及整体水平等探讨BM-MSCs发挥修复ALI的作用机制，为临床寻找BM-MSCs治疗ALI提供新的理论依据。

骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）可以改善急性肺损伤（ALI），本项目主要研究了BM-MSCs修复ALI的作用机制。结果表明：予以BM-MSCs条件培养基（MSC-CM）可以显著减轻LPS诱导ALI肺损伤程度及炎症反应。蛋白水平检测发现，予以MSC-CM后可以进一步上调LPS诱导ALI肺部自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I，下调p62水平。这表明，MSC-CM可以上调ALI的自噬水平。使用了自噬抑制剂氯喹（CLQ）以及自噬增强剂雷帕霉素（RAP）预处理LPS诱导ALI小鼠。结果显示CLQ增加ALI肺损伤程度及炎症反应；RAP显著减轻ALI肺损伤程及炎症反应。这表明，上调自噬水平可以保护ALI。最后，我们采用了LC3-/-小鼠模型进一步证实了自噬在MSC-CM保护ALI中发挥重要作用。. 细胞水平研究了MSC-CM对LPS刺激下肺微血管内皮细胞（HPMVECs）的作用。首先，MSC-CM可以显著降低LPS刺激下HPMVECs的细胞通透性以及炎症水平；CLQ减弱了MSC-CM的保护作用，而RAP促进了MSC-CM的作用。蛋白水平结果同样显示MSC-CM可以上调自噬相关基因Beclin-1的表达，下调p62表达。此结果再次证明了MSC-CM可以上调LPS刺激下HPMVECs的自噬水平。此外，MSC-CM可以显著降低LPS诱导的HPMVECs凋亡水平及通透性，采用siRNA抑制自噬相关基因ATG5后，MSC-CM的抗凋亡能力显著下降，HPMVECs的通透性显著升高。. 为了明确MSC-CM中发挥重要作用的细胞因子，蛋白芯片技术最终筛选出关键蛋白：核心蛋白聚糖（DCN）以及巨噬细胞移动抑制因子（MIF）。DCN可以增加LPS刺激HPMVECs的自噬水平，抑制MSC-CM的DCN水平后，MSC-CM上调LPS刺激HPMVECs的自噬相关蛋白Beclin-1的能力下降。此外，研究还发现MIF参与MSC-CM对HPMVECs的保护作用及上调自噬水平的能力。. 本项目研究结果从一个崭新的途径研究了BM-MSCs治疗ALI的机制，为临床更安全、方便的使用干细胞治疗ALI提供了理论指导。