线粒体膜通透转换孔（MPTP）在糖尿病加重脑缺血损伤中的作用及其NIM811干预机制研究

Hyperglycemia exacerbates brain damage induced by cerebral ischemia.The mechanisms responsible for such detrimental effects of hyperglycemia are fully understood.Mitochondria play a pivotal in mediating cell death after cerebral ischemic stroke.Under ischemic condi-tion,mitochondria form a permeability transition pore (MPTP) that allows releases of several pro-apoptotic proteins and activation of cell death pathways.Our preliminary study showed that hyperglycemia caused mitochondrial cytochrome c release in early reperfusion stage after a transient cerebral ischemia,suggesting hyperglycemia causes early damage to the mitochondria. In addition, MPTP inhibitor cyclo-sporine A (CsA) effectively protected brain from hyperglycemia-exacerbated ischemic damage.However,CsA inhibits both the MPT and neuroinflammation and it does not penetrate the blood-brain barrier.In the proposed study,we will induce transient cerebral ischemia in diabetic and nondiabetic rats, employ electron microscope, immunohistochemistry, western blotting, measurements of mitochondrial membrane potential, calcium loading capacity, respiratory function and activities of mitochondrial electron transport complexes to further study the role of mitochondria in ischemic brain damage;Use a specific MPTP blocker NIM811 to determine the role of MPTP in mediating hyperglycemia-enhanced ischemic brain damage; and Induce in vitro hypoxia model that mimics the in vivo hdiabetic ischemic conditions to delineate the acting mechanisms of NIM81.Cell viability, surtuin 3 activity, cyclophilin D acetylation,co-immunoprecipitation of cyclophilin D and adenine nucleotide tranlocase (ANT) will be studied for this purpose.The incidences of diabetes and cerebral stroke increased signifi-cantly in recent years among Chinese people. Delineating the role of mitochondria in hyperglycemia-enhanced ischemic brain damage will help us to understand the damage mechanisms and to develop new therapeutic drugs for clinical usage.

糖尿病加重脑缺血损伤机制不明，且无有效治疗措施。前期实验结果显示线粒体是糖尿病加重脑缺血损伤的重要靶标。本研究旨在阐明线粒体膜通透转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）在糖尿病加重脑缺血损伤中的作用以及新型MPTP阻滞剂NIM811对其损伤的保护及机制。本课题采用糖尿病脑缺血大鼠脑组织标本进行电镜、免疫组化染色、蛋白印迹、线粒体膜电位、钙承载能力和呼吸链酶复合物功能测定深入研究线粒体形态、功能及MPTP开放在糖尿病加重脑缺血损伤中的作用；通过与环孢素A和免疫抑制剂FK506的疗效对比，研究NIM811的保护效果，进一步阐明MPTP在介导糖尿病加重脑缺血损伤中的作用；采用细胞培养模拟体内高糖缺氧状态，通过测定Sirt3活性、亲环素D乙酰化，免疫共沉淀和siRNA技术研究NIM811作用的分子机制。本研究为防治脑卒中提供依据。

1.研究背景.全国第三次死因回顾抽样调查报告指出，脑卒中是我国目前第一死亡原因及成年人首位致残的原因。缺血性脑卒中占脑卒中的70%～80%，是严重危害人类健康的疾患。研究表明，糖尿病与脑卒中之间存在密切内在的联系,而且缺血性脑卒中本身所导致的应激反应可同时干扰糖代谢、诱导血糖升高。.目前认为, MPTP 是缺血缺氧后各种损伤的汇聚点,参与脑缺血缺氧损伤的.多种机制，但抑制MPTP开放在糖尿病加重脑缺血损伤中是否有神经保护作用尚未阐明，本课题的核心假说是：MPTP参与了糖尿病加重缺血性脑卒中损伤，并且在介导糖尿病加重脑缺血损伤中起主导作用。.2.研究内容.（1）明确MPTP 在糖尿病加重脑缺血损伤的作用：我们将在正常血糖和糖尿病大鼠缺血再灌注后分离其线粒体进行研究。分析指标包括线粒体的钙承载能力，线粒体膜电位变化，以及 MPTP 开放的标志----线粒体肿胀。.（2）应用新型 MPTP 特异性阻滞剂 NIM811，通过与CsA 和免疫抑制剂FK506 比 较功效，进一步阐明 MPTP 在介导糖尿病加重脑缺血损伤的主导作用。同时观察 NIM811 对糖尿病加重脑缺血性损伤的神经保护作用。.（3）应用小鼠海马神经细胞HT22株，模拟体内高糖缺氧的状态，进一步阐明NIM811对糖尿病加重脑缺血性损伤的神经保护作用及其干预的分子机制。.3.研究成果.  1．在正常血糖和糖尿病大鼠缺血再灌注损伤后分离线粒体进行研究，观察到线粒体存在典型损伤（线粒体肿胀，部分线粒体脊断裂，溶解），间接表明糖尿病再灌注损伤后MPTP开放。.  2．利用HT22细胞建立细胞损伤模型，通过检测线粒体相关动力学蛋白因子和线粒体膜电位，证实环孢素A及其衍生物NIM811对损伤的细胞及线粒体有保护作用。.4.科学意义.糖尿病是脑卒中患者常见的临床问题，本课题应用糖尿病脑卒中动物模型和体外细胞培养 OD 模型，观察MPTP 特异性阻滞剂NIM811在糖尿病加重脑缺血损伤所发挥的神经保护作用，NIM811已经进入临床二期试验，用于治疗脑外伤病人。本研究可为下一步临床转化研究奠定基础可期待它对指导防控脑卒中具有一定的应用的价值。