DNA甲基化-miRNA网络调控CD4+T细胞免疫失衡在重症肌无力发病中的机制研究

The modification of DNA methylation-miRNA epigenetic network is involved in immune disorders of a variety of autoimmune diseases, less is known about its role in the pathogenesis of MG. Our preliminary study had found that miR-155 and miR-146a play an important role in the abnormal immune response in MG patients, in addition, multiple autoimmune-related genes in CD4+T cells from MG patients were found to be aberrantly methylated . On this project, we will further explore the potential influence of DNA methylation-miRNA regulatory network on gene dysregulation of CD4+T cells and immune disorders in MG patients through integrated analysis of DNA methylation and miRNA expression; then to evaluate the fine regulation of DNA methylation on CD4+T cells both at cellular and whole animal levels, using scFvFoxp3-9R fusing with siRNA to induce the promoter of key gene methylation; to validate the screened miRNA-DNMT pathway through the dual luciferase reporter gene assay, miRNA over-expression and inhibition techniques，with a purpose to evaluate the potential impact of miRNA on DNA methylaion. We attempt to explore the DNA methylation-miRNA modificaion network in the pathogenesis of MG and provide a theoretical basis for new epigenetic therapy through this research.

DNA甲基化-miRNA表观遗传修饰参与了多种自身免疫性疾病的调控，但其在重症肌无力（MG）中的作用并不明确，我们的前期研究发现，miR-155和miR-146a在MG的异常免疫应答中发挥重要作用，MG患者CD4+T细胞中多个自身免疫相关基因出现甲基化异常。本项目拟进一步联合使用Illumina全基因组甲基化芯片和miRNA芯片探讨DNA甲基化-miRNA调节网络对MG患者CD4+T细胞免疫失衡的影响；利用单链抗体scFvCD4-9R负载siRNA靶向诱导CD4+T细胞差异基因甲基化，从细胞和整体水平探索DNA甲基化的精细调控在CD4+T细胞免疫应答中的作用；利用双荧光素酶报告基因、miRNA过表达和抑制试验对筛选出的miRNA-DNMT通路进行验证并探讨miRNA对DNA甲基化的的影响，从而阐明DNA甲基化-miRNA调控网络在MG发病中的作用及机制，为开发新的表观治疗方略提供理论依据。

重症肌无力（Myasthenia Gravis，MG）是一种由致病性自身抗体累及神经肌接头突触后膜的自身免疫性疾病，CD4+ T细胞的异常活化及免疫失衡在整个异常免疫应答过程中扮演关键角色。在MG患者外周血中自身反应性CD4+ T细胞克隆长期存在且亚群失衡，Th1、Th17、Tfh细胞及其细胞因子比例增加，在维持自身免疫耐受方面具有重要功能的Treg细胞功能缺陷，这导致MG患者持续产生自身抗体而迁延不愈。DNA甲基化是表观遗传学领域极为重要的一种调控机制，本课题组通过应用全基因组甲基化芯片及miRNA芯对6例MG患者和6例健康人的外周血CD4+T细胞的甲基化及miRNA表达情况进行研究，鉴别出了一系列甲基化差异基因及异常表达的miRNA。将这些差异表达的miRNA与甲基化差异基因进行联合分析，发现差异表达的miRNA的靶基因与甲基化异常的基因存在交集，这些差异基因包括：ICA1、CDH5、CD80、DEF8、C1orf159、PRDM7、SERPINA5、SPRR2D、BTBD11、BCLAF1、NEDD4L及FBXO27。本课题前期研究发现，与正常对照组相比，NEDD4L在EAMG组中高表达。NEDD4L属于NEDD4家族的泛素连接酶，目前研究最多的作用靶点是上皮钠通道（ENaC），其在维持钠平衡和血压中起重要作用，也有研究显示NEDD4L介导的泛素化参与调控肿瘤进展相关的TGF-β信号传导，但在免疫相关疾病中未见报道。在本项目的细胞水平研究中，我们发现NEDD4L在T细胞的诱导分化中，通过促进TGF-β信号通路中Smad2/3蛋白的降解，介导TGF-β信号通路下游关键转录因子RORγt和FOXP3的差异表达，诱导幼稚T细胞向Th17细胞分化，促进炎症细胞因子IL-17A的表达。提示NEDD4L介导的Th17/Treg细胞失衡可能是NEDD4L参与EAMG发病的机制。通过动物实验进一步验证通过干预NEDD4L表达可以减少EAMG小鼠炎症细胞因子IL-17A的表达，抑制EAMG的炎症反应，提示逆转Th17/Treg细胞失衡可能有助于缓解EAMG的炎症反应，为后续的EAMG相关的研究提供了理论基础。