五子衍宗丸调控精子线粒体通透性转换孔（mPTP）治疗少弱精子症机制研究

Oligoasthenospermia is a common incurable diseases of the male reproductive system，the incidence rate shows an upward trend,previous studies found that Wu Zi Yan Zong pill could tream this disease by protecting sperm mitochondria.While the openness of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) directly affects the structure and function of mitochondria and determines sperm survival, therefore we presume that mPTP might the regulatory targets of wuziyanzong pill on oligoasthenospermia. In this topics the wuziyanzong pill is to be the object and the mPTP as a starting point.The herb Tripterygium glycosides and glycoside preparation were used respectively to make mPTP open cell model and oligoasthenospermia rats, the sperm quality,mPTP opening,mitochondrial enzyme activity,membrane potential(MMP), ultrastructure were observed according to the openness of sperm mPTP, the effects of wuziyanzong pill on the expression of voltage-dependent ion channel (VDAC) ,the content of adenine nucleotide translocation of the enzyme (ANT), the expression of Bcl-2 family were studied by westblot, RT-qPCR, immunohistochemistry methods, and analyzed the mechanism of mPTP regulation. The study examined the internal relations of mPTP and oligoasthenospermia and researched the mechansim of Wu Zi Yan Zong pill regulation. According to the topics,we will likely to reveal the molecular mechanism of male infertility , and look for a new and effective treatment.

少弱精子症是常见疑难病症，其发病率呈上升趋势，目前现代医学无特效治疗手段。五子衍宗丸为治疗该症的经典补肾方药，我们前期研究发现，五子衍宗丸通过保护精子线粒体发挥治疗作用。而线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放程度直接影响线粒体的结构与功能，故推测mPTP为五子衍宗丸治疗少弱精子症的调控靶点之一。本课题以mPTP为切入点，分别采用苍术苷和雷公藤多苷制备mPTP开放和少弱精子症模型，以mPTP调控因素为研究核心，观察五子衍宗丸对精子电压依赖性阴离子通道（VDAC）表达、腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）含量的影响，以及对Bcl-2家族表达、mPTP开放程度、线粒体膜电位水平、超微结构的干预作用，分析其调控机制。该研究考察mPTP与少弱精子症的内在联系和五子衍宗丸的调控机制，将可能为揭示肾虚精亏的分子机制、寻找新型有效的治疗途径提供崭新思路，为阐述补肾法的现代科学内涵提供新视角。

五子衍宗丸为临床治疗少精子症的经典方剂，前期研究发现五子衍宗丸通过保护精子线粒体发挥治疗作用，而线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放程度直接影响精子线粒体的结构与功能，因此本项目以mPTP为切入点，深入研究mPTP与少弱精子症之间的关系，并采用雷公藤和苍术苷（mPTP开放剂）制备少弱精子症模型，研究五子衍宗丸调控mPTP治疗少弱精子症的作用机制。该研究结果将为临床治疗少弱精子症提供新途径，为阐述补肾法的现代科学内涵提供新证据。为此本项目开展了如下研究：（1）五子衍宗丸不同配伍的4种黄酮类有效成分的变化研究及大鼠药代动力学研究（2）五子衍宗丸调控mPTP治疗少弱精子症的部分机制研究（整体动物模型）（3）初步建立了苍术苷制备mPTP精子模型，并着手开展五子衍宗丸含药血清对mPTP精子模型的影响。结果发现：（1）菟丝子与枸杞子、五味子、覆盆子配伍后各组中金丝桃苷和紫云英苷的含量均有显著增加，槲皮素和山柰酚含量的无明显变化；其中金丝桃苷的含量与配伍前比分别增长了 53.50%、27.89%、24.30%；菟丝子与车前子配伍后 4 种活性成分的含量均有减少。（2）金丝桃苷单体在大鼠体内吸收迅速，半衰期短，Tmax为0.39 h，t1/2为0.04 h。与金丝桃苷组比，菟丝子及其配伍各组，药-时曲线呈现双峰吸收现象，t1/2，AUC0-t明显增大，MRT0-∞显著增加，Tmax明显延迟，差异有显著性意义（p<0.05）；与菟丝子组比，菟丝子-枸杞子组Cmax、AUC0-t明显增大、MRT0-∞显著增加，说明枸杞子的配伍可促进金丝桃苷在大鼠体内的吸收，并延长了其在大鼠体内的滞留时间，起到协同增效的功效；菟丝子-车前子组Cmax，AUC0-t明显降低，t1/2、MRT0-∞显著减小，说明车前子的配伍可降低金丝桃苷的血药浓度，显著延缓金丝桃苷的吸收，推测车前子的配伍对金丝桃苷在大鼠体内的吸收可能起抑制作用；五子衍宗丸组 Cmax，AUC0-t，MRT0-∞明显增大，差异有显著性意义（p<0.05），表明全方配伍后可促进金丝桃苷在大鼠体内的吸收，保持较高的血药浓度，且体内分布加快，明显提高了生物利用度。（3）五子衍宗丸能明显降低雷公藤多苷所致的精子凋亡，其机制是抑制精子线粒体通透性转换孔开放。