HSP70-HTNV 重组病毒样颗粒诱导特异性抗汉滩病毒免疫的研究

现有灭活疫苗对降低肾综合征出血热（HFRS）发病率起到重要作用，但其本身还存在一些不足。病毒样颗粒（VLPs）是一种不含病毒核酸的空壳结构，与天然病毒颗粒结构相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体产生免疫应答。研究表明VLP疫苗具有长期的保护作用，免疫效率高，其效果优于灭活疫苗,可能成为未来疫苗的发展方向。文献报道汉坦病毒GP，NP可以在体外自主形成VLP，但未见其免疫动物的相关后续报道，可能与VLP的表达量低、稳定性差或免疫原性弱有关。我们以往研究表明，HSP70-HTNV NP融合蛋白可以增强诱导特异性细胞和体液免疫反应，其中HSP70发挥着重要作用。本课题拟利用昆虫-杆状病毒表达HSP70,HTNV S,HTNV M基因全长，观察其组装成病毒样颗粒的情况及其特点，并用以免疫小鼠，研究其诱导小鼠产生的 HTNV 特异性免疫保护反应，为HFRS的防治提供实验基础。

病毒样颗粒（VLPs）是一种不含病毒核酸的空壳结构，与天然病毒颗粒结构相似，可通过与病毒感染相同的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体产生免疫应答。本课题利用昆虫-杆状病毒共表达 HSP70、汉坦病毒 G1、G2、S 基因全长，观察其组装成病毒样颗粒的特点，并研究其诱导小鼠产生HTNV NP的特异性免疫反应。研究内容主要包括以下几个部分：.1、杆状病毒表达载体的构建及鉴定。构建杆状病毒表达质粒pFastBac-G1, pFastBac-G2, pFastBac-S和pFastBac-HSP70，通过酶切、测序及 PCR 鉴定，并在DH10Bac中通过蓝白筛选实现转座，获得重组Bacmid DNA。.2、在昆虫细胞 Tn5 中共表达质粒 G1, G2, S和HSP70，通过SDS-PAGE, Western Blot验证其表达效果，结果显示重组蛋白主要存在细胞培养上清中，电镜证实病毒样颗粒的形成。.3、建立表达HTNV S基因的B16细胞。构建pcNDA3.1/S 真核表达载体，转染B16细胞，通过G418进行稳定筛选，分别从DNA，mRNA和蛋白水平检测HTNVS的表达。.4、纯化HTNV-VLP蛋白诱导抗HTNV NP的研究。间接ELSA结果表明，HTNV-VLP免疫的小鼠血清中，抗HTNV-NP的抗体水平明显升高(P<0.01)，以IgG2a升高为主，IgG2a/lgG1比值升高P(<0.01)，提示体液免疫反应有从Th2型向Thl型转化的趋势。体液免疫反应的增强所产生的抗体具有交叉免疫的特点，可同时识别HTNV 76-118株、SEOV L99株以及体外原核、真核细胞表达的HTNV NP；INF-γELISPOT检测结果表明，HTNV-VLP免疫小鼠脾淋巴细胞中针对B16-NP的特异性T细胞数量显著增加 (P<0.01)； LDH 释放实验检测脾淋巴细胞毒性，结果表明，HTNV-VLP免疫的小鼠脾淋巴细胞可以显著增加对B16-NP细胞的杀伤效果(P<0.01)，但对B16细胞的杀伤效果没有显著的影响 (P>0.05)。. 我们的研究结果表明，在昆虫杆状病毒系统中，HSP70与汉坦病毒 G1、G2、S 基因可以共表达形成病毒样颗粒（HTNV-VLP），增强诱导 HTNV NP 特异性细胞免疫和体液免疫反应，其中HSP70 发挥着重要作用。