仿生纳米材料诱导UCMSC成肌腱分化和异体UCMSC再生肌腱的实验研究

Human umbilical cord matrix derived-mesenchymal stem cells(UCMSCs) are convenient to harvest, potent in proliferation and multidifferentiation with low immunity. We hypothesize that UCMSCs can be tenogenically induced with mimetic tendon topography and tendon ECM components and thus serve as a allogenic cell source for tendon regeneration. This study employed tenogenic potent UCMSCs with cells sorted with the markers of CD29+/CD44+/CD34-/CD45-, which will be seeded on aligned microgrooved topographical surface coated with ECM for tenogenic differentiation. Further, tendon ECM and PCL will be used to electrospun parallel aligned nanofiber scaffold to biomimic both collagen fibrillar nanotopographical signal and ECM signal of native tendon tissue, and the biomimetic scaffold will be used for UCMSCs tenogenic differentiation, and the study will explore its related mechanism. Furthermore, UCMSC seeded biomimetic scaffold will be implanted in vivo along with mechanical loading to enhance cell based tendon regeneration. Finally, UCMSCs will be used as allogeneic seed cells to explore the possibility of engineering tendon tissue with immunogenicity analysis of tenogenic differentiation UCMSCs. This potential achievement may develop universally applicable tendon graft for tendon repair, and this may overcome the bottleneck of individual based tendon engineering therapy.

人脐带间充质干细胞（UCMSCs）获取方便、扩增能力强、具有多向分化潜力和免疫原性低等特性。本研究提出假说：UCMSCs可通过含有肌腱细胞外基质（ECM）且仿生肌腱组织结构的平行排列纳米材料诱导为肌腱细胞并可作为异体种子细胞再生肌腱组织。本研究拟采用CD29+/CD44+/CD34-/CD45-分选具有成肌腱分化潜能的UCMSCs接种在铺有ECM平行刻纹结构表面膜上诱导为肌腱细胞，进一步将肌腱ECM与聚己内酯结合通过电纺丝制备成纵向排列纳米纤维材料，综合模拟肌腱中平行排列纳米胶原纤维拓扑结构和ECM成分诱导UCMSCs成肌腱分化并探讨相关机制。在此基础上将接种细胞的诱导支架材料植入动物体内并受力学刺激促进UCMSC再生肌腱。探讨UCMSCs分化为肌腱细胞后的免疫原性，以将其作为异体种子细胞修复肌腱缺损。这一预期成果有望形成通用型肌腱移植物用于肌腱缺损修复，突破组织工程肌腱个体化治疗的瓶颈。

目的：将肌腱细胞外基质（extracellular matrix, ECM）修饰在平行排列的静电纺纤维上可同时模拟肌腱组织内胶原纤维的平行排列拓扑结构和ECM成分产生的诱导信号刺激，并为MSCs（mesenchymal stem cells, MSCs）向肌腱谱系分化提供合适的微环境。本研究旨在探讨肌腱ECM修饰后的平行电纺纤维对MSCs的体外成肌腱分化和力学负荷下对体内肌腱原位再生的促进作用，并进一步验证ECM成分中的Ⅰ型胶原和fibromodulin结合在有序的纳米纱上诱导人脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ASCs）成肌腱分化的作用。.方法：将牛肌腱ECM中的可溶性基质成分提取出来并添加到培养基用用于体外培养小鼠MSCs，检测细胞的增殖状态、骨架形态和各向分化相关的基因表达水平的变化。然后通过同轴共纺技术将上述成分整合到平行纤维支架中，检测支架上细胞增殖、细胞活力、基质分泌和基因表达水平的改变。另一方面，将无细胞的ECM修饰的平行中性纤维支架植入大鼠跟腱缺损处，观察其在力学负荷下对肌腱再生的作用。人ASCs被接种在Ⅰ型胶原和fibromodulin修饰的相对有序的纳米纱上并检测其在支架上的增殖、基质分泌、基因表达变化和ASCs作为种子细胞的体外构建肌腱组织的成熟度。.结果：单一的可溶性肌腱ECM成分在增强成肌腱相关基因的表达的同时也增强了其他组织标记物表达。但在平行排列的中性纤维上，肌腱ECM成分仅增强成肌腱相关基因的表达，同时也强化了细胞增殖与分泌基质的能力。肌腱ECM修饰的平行中性纤维在体内起到了促进新生肌腱成熟、加速胶原组装的作用。Ⅰ型胶原和fibromodulin促进了人ASCs在纳米纱支架上的增殖和基质分泌，特别是fibromodulin可以抵消外源性胶原成分对细胞内胶原合成的负反馈作用。进一步地，Ⅰ型胶原和fibromodulin加速了人ASCs为种子细胞构建的肌腱组织在体外的成熟。.结论：本研究利用同轴共纺技术将肌腱ECM中的有效诱导成分、支架酸中和功能与有序电纺纤维结合制备出了具有高效诱导作用的生物活性支架，并证明了其在力学刺激下促进肌腱在原位再生的功能。在此基础上本研究进一步制备了针对人ASCs的仿生诱导支架，为后期应用与机制研究奠定了基础