融合靶向肽与穿膜肽的仿生型纳米载体介导siRNA抗肿瘤主动靶向给药系统的研究

本项目基于仿生型纳米载体- - 重组高密度脂蛋白（rHDL）的类内源性、结构两亲性及高效运载性等优势，结合肿瘤细胞靶向肽（tCTP）与穿膜肽（tCPP）靶向性强、穿膜效率高的优点，首次针对rHDL进行表面tCTP共价修饰和tCPP非共价修饰，构建肿瘤组织高度靶向、肿瘤细胞高效穿透的siRNA载体- - 靶向肽与穿膜肽双重修饰的rHDL（TP-rHDL）。在此载体基础上，应用siRNA亲脂性修饰技术，旨在制备一种高效低毒、肿瘤靶向、可静注的TP-rHDL/亲脂性siRNAs抗肿瘤纳米复合物。在体内输送过程中，该复合物凭借tCTP主动靶向于整合素受体αvβ3高表达的肿瘤组织，通过肿瘤细胞膜αvβ3受体与tCPP双重介导，利用共转染技术将siRNAs高效导入肿瘤细胞，特异性沉默关键癌基因。项目将重点围绕TP-rHDL/亲脂性siRNAs复合物的制备、质量评价、体内外基因沉默效果及抗肿瘤活性等展开研究。

本项目模拟血浆中天然存在的脂质转运载体——高密度脂蛋白（HDL），设计并构建了仿生型纳米载体重组高密度脂蛋白（rHDL）介导的siRNA靶向递送系统（rHDL/Chol-siRNA 纳米粒）：选取大豆磷脂、胆固醇、胆固醇酯和胆固醇修饰siRNA等制备载siRNA纳米脂核（Lipos/Chol-siRNA纳米粒）；纳米脂核外围再由载脂蛋白A-I（apoA-I）包覆。在环五肽c(RGDfk)结构的基础上设计肿瘤细胞靶向肽（tCTP），筛选得到受体结合活性更好的c(RGDyk)，然后在apoA-Ⅰ的赖氨酸残基上修饰c(RGDyk)制得c(RGDyk)-apoA-Ⅰ。在R3H6结构的基础上设计肿瘤细胞穿膜肽（tCPP），筛选得到穿膜能力更强的R8H3，然后采用硬脂酸（SA）对R8H3的 N 端修饰得两亲性SA-R8H3。针对目标基因Pokemon，设计并制备了siRNA-Pokemon，通过RT-QPCR和MTT法筛选出高效靶向siRNA序列。在rHDL/Chol-siRNA 纳米粒的基础上，构建靶向肽与穿膜肽双重修饰的rHDL (TP-rHDL)/Chol-siRNA纳米粒: 薄膜分散法制备Lipos/Chol-siRNA纳米粒，再将c(RGDyk)-apoA-Ⅰ和SA-R8H3与之共孵育，制得TP-rHDL/Chol-siRNA纳米粒。该纳米粒siRNA包封率高、粒径适宜，具有良好的体外稳定性和释药行为。TP-rHDL/Chol-siRNA-Pokenmon纳米粒在体外细胞实验中表现出无明显的空载体（TP-rHDL）细胞毒性、较高的Chol-siRNA-Pokenmon细胞摄取效率和抗肿瘤活性，在体内动物实验中表现出较强的肿瘤靶向性、Pokenmon基因沉默效率、肿瘤生长抑制率和无明显的正常组织毒副作用。综上所述，本项目对仿生型纳米载体rHDL进行表面修饰（化学修饰：在rHDL表面apoA-Ⅰ的赖氨酸残基上共价修饰c(RGDyk)，物理修饰：SA-R8H3插入到rHDL的磷脂单层中）,以赋予其新的肿瘤识别标志（整合素受体αvβ3）和肿瘤细胞穿膜特性，可增强其介导的siRNA递送系统的肿瘤靶向性，实现肿瘤组织特异性基因沉默，进而提高其抗肿瘤治疗效果、减少毒副作用。因此，这种将载体靶向与穿膜特性联合起来的研究设计方案，更加符合当今肿瘤靶向治疗的趋势，具有广阔的应用前景。