四膜虫无性与有性生殖过程中Ran GTPase的定位与功能分析

细胞内信号转导过程中，小GTPase蛋白Ras超家族起到重要的网络调控作用。其中Ran GTPase参与调控许多重要细胞生命活动，如核膜重建、核质间物质转运、纺锤体组装等。四膜虫细胞中同时含有营养核和生殖核，并具有无性生殖和有性生殖过程。本研究以四膜虫为模式生物，构建Ran GTPase基因敲除、 HA/GFP-Ran GTPase、过表达Ran GTPase的同源重组盒，建立相应的基因缺失、蛋白标记和过表达细胞菌株，通过特定的细胞表型，分析Ran GTPase的功能；构建GTP水解缺失突变体RanQ69L、GTP/GDP结合能力丧失突变体RanT24N以及以结合GDP为主的C末端缺失突变体，分析Ran GTPase在不同的生理状态下在细胞中的定位模式。单细胞真核生物四膜虫细胞中Ran GTPase的功能分析,为进一步阐明该蛋白在细胞内核质互作过程中的作用和精细的分子调控机制提供科学依据。

Ran蛋白作为重要的细胞增殖调控因子，能够与不同的调控因子和效应分子相互作用, 在有丝分裂、减数分裂及细胞凋亡过程中发挥作用。本研究对Ran蛋白及其调节因子在嗜热四膜虫大核无丝分裂和亲本大核程序性死亡过程中的调控功能进行研究，获得如下结果：1. 四膜虫RAN1全长1443 bp，编码225个氨基酸, 包含小GTPase蛋白共有的GDP/GTP结合区和开关结构域。RAN1基因在四膜虫整个生命周期中都有较高的表达水平。2. Ran1以及模拟GDP、GTP锁定形式的Ran1突变体表现出不同的大核定位模式。i∆RAN1细胞表现出繁殖速度下降及大核无丝分裂异常。无丝分裂时期大核内微管排列形式紊乱，从而使得复制的大核染色体不能分开，最终导致大核增殖受阻。3. 敲减RAN1基因导致亲本大核的PND进程受到抑制，RAN1敲减细胞与RAN1过表达细胞接合配对，PND抑制得到一定程度的恢复。敲减RAN1基因抑制调控凋亡促进因子AIF向PND的亲本大核转移，并且Ran1GDP和Ran1GTP分别促进和抑制AIF的核输入，表明Ran1 GDP/GTP循环可能参与调控AIF向PND的亲本大核运输。 4. 鉴定了四膜虫Ran 胞质调节因子RBP1基因，RBP1的过表达和敲减均导致细胞异常发育，这种异常表型与GTP和GDP锁定形式的RAN1突变体的表型相一致，暗示Rbp1p可以调节正常的Ran-GTP/GDP的浓度梯度，进而影响细胞核的发育。5. 鉴定了Ran 核内调节因子RCC1基因. RCC1在四膜虫营养生长、饥饿以及有性生殖时期都有表达. HA-RCC1在营养生长和饥饿时期定位于大核和小核中；在有性生殖时期,定位于亲本大核，减数分裂的小核，新生成的大核和凋亡的大核中. 过表达RCC1导致大核的无丝分裂异常, 细胞增殖变慢, 最终产生无大核的后代细胞. 敲减RCC1导致了多小核的产生, RCC1参与调控了四膜虫细胞核的分裂, RCC1的正常表达对核分裂以及细胞增殖起到重要的调控作用. 我们首次报道了Ran及其调节因子在原生动物中的定位和功能，Ran 蛋白不仅调节了无性生殖过程中大核的无丝分裂的进程，而且调节了有性生殖中大核的凋亡途径。Ran 蛋白的信号通路在进化中是一种保守的代谢途径。