流感病毒NS1/CPSF30结合的环肽类拮抗剂设计、生物合成及活性研究

甲型H1N1、禽流感等流行对我国社会生活与人民生命健康造成较大的危害，因临床用药短缺，急需研究有效治疗药物，以增强应对突发流感流行公共卫生事件的能力。在科技部甲型H1N1流感联防联控应急项目中根据流感NS1蛋白与人功能蛋白CPSF30结合破坏人体防御系统的原理，建立了其拮抗剂筛选模型；并用活病毒侵染筛选到4个有抑制病毒浸染的环肽分子。项目拟在此基础上设计并生物合成针对NS1/CPSF30结合的环肽类拮抗剂，将CPSF30锌指结构F3的活性肽段嫁接到活性环肽的分子模板上，生物合成既能与NS1结合又具有刚性结构的可口服环肽拮抗剂，并对其成药性进行初步评价。所选流感病毒的靶点在流感病毒中普遍存在，并具有保守性。因此，获得的环肽拮抗剂具有广谱性，适于甲型流感的不同亚型。该工作涉及的NS1/CPSF30拮抗剂模型、药物合成设计及抗甲流环肽分子模板均未见报道，有自主知识产权，有创新性和实用性。

甲型流感病毒是导致季节性、高死亡率的重要毒株，其毒力因子NS1A蛋白的功能是抑制编码β-干扰素和其它抗病毒相关蛋白的mRNAs合成，其作用方式是通过NS1A与宿主细胞参与前体mRNAs成熟的剪切和多聚腺苷酸化因子30 kDa亚单位（CPSF30）结合而抑制抗病毒相关mRNAs的成熟。本研究以CPSF30与NS1A相互作用的锌指结构F3为分子骨架，生物合成靶向作用于NS1A的环多肽分子。完成了研究计划要点的全部内容，取得以下研究结果：.⑴利用内含肽（Intein）表达系统表达获得人CPSF30锌指F3肽段，确定了与NS1A相互作用的肽段：建立内含肽的双元表达系统，利用共表达的甲硫氨酸氨肽酶（MAP）特异剪切目的融合多肽分子的Met，然后经几丁质柱纯化，由还原剂MESNA介导剪切和环化，经HPLC纯化获得目的分子。.⑵进行活性表位的氨基酸残基突变研究，尤其是与结构稳定性相关的Cys突变提高分子的稳定性。.⑶完成了8个样品的抗病毒活性分析，结果表明其选择指数较差，即没有获得抗病毒活性高的环肽。.⑷环状结构和二硫键的形成增强环肽分子抗胰蛋白酶酶解的稳定性，为研究口服给药提供经验借鉴。.⑸建立了由分选酶（Sortase A）介导的化学-酶法多肽合成方法，利用合成的3个线性肽为研究目标，建立生物催化方法。.⑹利用化学-酶法合成4个多肽分子，将继续进行抗病毒活性评价分析：所表达的目的多肽结构为：标签Trx-TEV识别位点-目的多肽-6×His标签,由蛋白酶TEV剪切去除N-端的融合标签，经亲和层析纯化；再加入纯化的分选酶催化目的分子环化，再经HPLC纯化获得目的环肽分子。已经利用该表达系统合成制备了4个多肽分子，抗病毒活性评价将继续进行。.此外，在项目实施过程中，发现NS1融合蛋白存在自剪切的现象，通过肽指纹初步确定了其自剪切的区段，可能是一个甲型流感病毒致病机制的新发现。.在项目基金的资助下，也获得了2个具有较高的抗甲型流感病毒活性的天然植物环肽分子，其IC50值分别是7.09±0.62×10-7 mol/L和9.267±1.64×10-7 mol/L， 最大无毒浓度分别为1.25×10-5 mol/L和0.5×10-4 mol/L，可作为分子模板进行深入研究；还进行了肠道病毒EV71的研究，尤其是针对其3C蛋白酶，分离鉴定了具有很好的抑制其活性的小分子化合物。