用谱系追踪系统研究缝隙连接介导的钙瞬变对心肌梗死后心肌细胞再分化的影响及其机制

Adult cardiomyocytes (ACM) dedifferentiation / redifferentiation is an important source of endogenous myocardial regeneration in infarcted heart, but the underlying mechanism for ACM redifferentiation is unknown. Ca2+ dependent MEF2,MyoD and NFAT pathways regulate the differnetiation of stem cell towards ACM. Our previous study suggested that the formation of gap junction with adjacent cells and Ca2+ transient are both necessary for ACM redifferentiation. Ca2+ transient regulates the intracellular Ca2+ concentration, whose intercellular propagation is based on gap junction. Hypoxia/ischemia closes gap juction by dephosphorylating the major gap junction protein connexin 43 (Cx43) at serine residues 325/328/330, thereby inhibiting the propagation of Ca2+ transient.We hypothesize that Cx43 mediated calcium transient promotes ACM redifferentiation by regulating Ca2+ dependent pathways, and that re-building the gap junction can promote endogenous myocardial regeneration by enhancing ACM redifferentiation in infarcted heart. Based on a lineage tracing mouse system, this study aims to identify if and how Cx43 mediated calcium transient regulates ACM redifferentiation, by manipulating gap junction function and Ca2+ transient properties with methods such as modifying the phosphorylation sites of Cx43, and by analyzing changes of Ca2+ dependent pathways in the process of ACM redifferentiation.

成年心肌细胞（ACM）去分化/再分化是心肌梗死后内源性心肌再生的重要途径之一，但ACM再分化的调控机制不详。Ca2+依赖的MEF2、MyoD、NFAT信号通路可调控干细胞向心肌细胞的分化和成熟。我们的前期工作提示与相邻细胞建立缝隙连接和钙瞬变的传入是ACM再分化的两个必要条件。钙瞬变调控胞浆内Ca2+浓度变化，其传导的结构基础是缝隙连接。缺血缺氧使缝隙连接蛋白43（Cx43）的325/328/330等位点去磷酸化从而关闭缝隙连接，阻止钙信号在细胞间传导。我们假设：Cx43介导的钙瞬变通过影响Ca2+依赖信号通路调控ACM再分化，缝隙连接重建可促进心肌梗死后ACM再分化而增强内源性心肌再生。本项目拟采用谱系追踪小鼠系统，通过修饰Cx43磷酸化位点等手段干预缝隙连接功能和钙瞬变特性，检测ACM再分化过程中的Ca2+依赖信号通路，探讨Cx43介导的钙瞬变对ACM再分化的影响及其分子机制。

促进内源性心肌再生是修复心肌梗死的重要途径。近年来基于谱系示踪技术的研究显示原有心肌细胞增殖是成年哺乳动物心肌再生的重要来源，但具备增殖潜力的心肌细胞亚群及其增殖机制尚不清楚。. 本项目利用心肌特异性谱系示踪小鼠的成年心肌细胞与新生大鼠心肌细胞的共培养，结合活细胞工作站实时成像和胞核标记技术，模拟心肌梗死后梗死边缘区的缺血心肌细胞，建立了成年心肌细胞胞质分裂的体外研究模型（国家发明专利受理中，申请号201611082429.5，第一完成人）。我们用该模型记录到成年小鼠心肌细胞分裂增殖的完整过程，为成年哺乳动物心肌增殖提供了直接证据。成年心肌细胞在特殊条件诱导下具有较强的再生能力，增殖的比例可高达7%。首次发现心肌增殖与细胞核个数和细胞体积大小无关，即终末分化的“成熟”心肌细胞也具备增殖能力。. 我们通过分析心肌细胞胞质分裂前后的形态学特征、生物标记物表达、电生理及收缩功能等指标的时间依赖性动态变化，发现“去分化→增殖→再分化”三环节是其再生出子代心肌细胞的主要模式。我们发现细胞间钙信号传递对于再分化的重要性。相邻心肌细胞经Cx43传入钙瞬变，继而激活胞内Ca2+依赖性的Calcineurin-NFAT信号通路是子代细胞再分化的调控机制。通过修饰Cx43的关键磷酸化位点可增强缝隙连接功能而提高再分化效率从而促进心肌梗死后的心肌再生。.该研究入选美国心脏学会2016基础科学领域的最新前沿进展（AHA Late-Breaking Basic Science，摘要发表在Circ Res. 2016;119:e162），项目负责人受邀在美国心脏学会2016年会作专题报告。该论著在Circulation发表后得到Nature子刊的专题述评（Nat Rev Cardiol. 2017;14(9):505），称其是心肌再生领域的重要发现，为心肌梗死和心力衰竭开辟了新的治疗策略；并被该刊评价为2017年度心肌再生领域影响未来的里程碑式进展之一（Nat Rev Cardiol. 2018;15(2):73-74）。被《中国循环杂志》评为2017年度中国心血管病十大科学研究。. 本项目发表SCI 论著1篇，发表在心血管权威期刊Circulation，影响因子为18.9，达到计划研究的目标。申报国家发明专利1项（实质审查阶段）。