拟南芥春化相关基因laf1的克隆及功能分析

由营养生长向生殖生长转变是植物生命活动中的重要发育事件，春化作用作为与低温有关的环境因素，对植物在合适季节准确开花以获得最大繁殖效率有非常关键的作用。我们将FRI-FLC途径为主要春化应答途径的冬季生态型C24背景拟南芥为材料，以春化4周后的开花时间为筛选条件，从EMS诱变的拟南芥库中筛选得到1株春化反应不完全的晚花突变体laf1，其开花时间晚于野生型，4周春化处理后其晚花表型有所恢复，但仍比野生型晚。已有图位克隆结果推测其为一未知基因，拟通过详细分析其基因结构、细胞定位及组织表达等情况，并结合不同处理条件对突变体、超表达植株和双突变体的表型进行比较分析，寻找与其参与途径及相关组分，进而利用体内双分子荧光互补、酵母双杂交等技术在细胞及分子水平研究其功能，最终揭示该基因在春化调控开花时间信号途径中的作用机制，为低温处理调节作物及园艺植物应用提供遗传材料及理论依据。

春化作用对植物在合适季节准确开花以获得最大繁殖效率非常关键，不同拟南芥生态型之间对于春化作用的响应存在着很大差别。但以往对春化相关的研究集中在FRI-FLC功能获得型Col-0或Ler等原本对春化不敏感的生态型中，而对于天然存在有FRI-FLC功能的C24这类冬季生态型的研究却很少。因此，本研究通过对C24背景的对春化反应异常的晚花突变体laf1的研究，希望发现冬季生态型中自身特有的调控途径或组分。但在研究过程中，多次的图位克隆仍未能找到突变位点，后经过野生型背景的C24与Ler或GL1杂交，发现F2代会出现分离，表现出复杂的开花时间分布，推测图位克隆的失败是由这种背景间差异所引起的挑苗不准导致的。因此在后面的研究中采用全基因组测序技术，并结合回交F2代株系混合分组深度测序定位突变位点，筛选到10个突变位点，正在进一步进行突变体确认及回补实验。此外，不同开花时间影响因素处理下的表型分析发现，随着春化时间的延长，laf1的莲座叶数目和开花时间与野生型的差距逐渐减小，在春化处理8周时开花时间最终趋于一致。而光周期的改变及赤霉素处理均不能改变laf1的晚花表型。这表明laf1对春化作用敏感，突变所在基因可能以负调控因子参与了春化相关途径。而对开花临界点前突变体及野生型植株常见开花调控关键基因的RT-PCR结果显示，突变基因除了影响春化相关基因FRI的表达，还导致自主途径中FCA的表达异常。对开花临界点前laf1植株的蛋白组学分析则发现了一些包括功能未知蛋白在内的一些蛋白在突变体中表达异常，在后续的工作中拟进一步研究这些蛋白是否参与春化或开花调控及其在这些途径中所起的作用。.此外，还合作开展了水稻脂酰ACP还原酶DPW的晶体学结构研究，成功获得DPW蛋白的晶体并解析了蛋白结构，通过结构比对及体内体外相关实验，发现其还具有UDP-葡萄糖差向异构酶活性，表明其为一个同时参与糖代谢和质代谢两大途径的双功能酶，为后续体内功能研究其在水稻花粉发育中所起的作用机制提供了新的思路。