拟南芥花粉外壁发育相关基因的克隆和功能分析

花粉外壁在抵御不同环境压力，微生物侵袭和细胞识别中起重要作用。花粉外壁发育的调节机理是生物学的基本理论问题。我们在前期工作中发现T-DNA纯合插入突变体def1、def2植株表型可育，但花粉外壁发育存在缺陷。nef2和nef3是两株无花粉外壁形成的雄性不育突变体，初定位结果表明基因NEF2和NEF3是新的控制花粉外壁发育的遗传位点。本项目将从三个方面进行研究：（1）克隆基因DEF1、DEF2、NEF2和NEF3；（2）利用RT-PCR、原位杂交和组织印迹等方法分析基因DEF1、DEF2、NEF2和NEF3的表达谱和时空关系；（3）用细胞学方法观察def1、def2、nef2和nef3突变体花粉发育过程，分析基因DEF1、DEF2、NEF2和NEF3的功能。本项目的完成将极大地促进我们对花粉发育过程中，基因之间相互关系以及细胞之间相互作用的了解，并为进一步阐明花粉外壁发育的分子机制奠定基础。

拟南芥的花粉壁包括花粉外壁和花粉内壁，其形成机制是一个重要的生物学问题，已有的研究发现了众多基因参与或调控花粉壁的形成。我们在前期的工作中发现转录因子MS188（MYB103）调控绒毡层细胞的功能分化，胼胝质的降解和花粉壁的形成，并根据ms188突变体的芯片数据购买了24个株系的Salk T-DNA 插入突变体，从中筛选到了7个雄性不育突变体株系。在本项目资金的资助下，克隆了DEF1 、NEF2 、NPG（DEF2）和FNE四个基因。.（1）克隆了DEF1基因。该基因在花药发育第7和第8期的绒毡层细胞和小孢子细胞中表达，过量表达DEF1 造成雄性完全不育。通过对def1突变体和过表达DEF1蛋白转基因植株花药的细胞学观察，证实了DEF1是一个调控花粉内壁和外壁形成的关键转录因子。.（2）通过def2突变体背景的纯化和F2代群体表型分析，筛选到一株由单个隐性基因控制拟南芥雄性不育突变体npg，并证实 npg与tdf1等位。.（3）从Salk_118481株系中筛选出一个由单个隐性基因控制的花丝不能伸长的雄性不育突变体fne (filament no elongation)，目前已经克隆了FNE基因，完成了互补实验。.（4）通过等位分析，证实了nef2和nef3与ms188不是等位基因，并且nef2与nef3也不是等位基因。nef2初定位在第五条染色体上，与分子标记MJH24连锁；nef3初定位在第三条染色体上，与分子标记CIW4连锁。目前用等位分析的方法克隆了NEF2基因，nef3突变体已完成了背景纯化，正在用图位克隆的方法克隆NEF3基因。.综上所述，已经克隆了2个新的调控花粉壁发育的基因DEF1 和NEF2，1个新的调控花丝伸长的基因FNE，1个已知基因TDF1的等位基因NPG，NEF3也可能是调控花粉外壁发育的新遗传位点，对上述基因功能的深入研究必将加深我们对花粉壁形成的分子机制的理解。