线粒体糖尿病小鼠模型的建立及其发病机制研究

线粒体DNA突变是导致糖尿病的重要原因，但是对于其机制仍知之甚少，主要原因是缺乏有效的动物模型用于研究。线粒体是一种半自主细胞器，受到线粒体基因组和核基因组两套遗传系统的共同控制，根据这一机理，可以通过改变核内基因表达制备线粒体疾病模型。TRMU基因为核内编码，负责线粒体内tRNA的修饰，对于维持线粒体的正常功能具有重要的作用，我们实验室学术带头人管敏鑫教授首次确定该基因可以影响线粒体耳聋表型，为一种核修饰基因。我们更进一步的研究发现该基因knockdown可以影响胰岛β细胞和肝脏细胞的功能。基于上述理论和实验基础，本课题拟通过RNAi技术制备TRMU-shRNA转基因小鼠，模拟线粒体糖尿病发病过程（胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗），研制新的糖尿病小鼠模型，并在此基础上观察胰岛素信号通路及心肾等脏器的变化，探索糖尿病的致病机制；同时本课题也是TRMU基因与疾病关系的深入研究。

本课题围绕线粒体功能障碍与2型糖尿病的发生，旨在通过建立针对编码线粒体蛋白质核基因的Knockdown转基因小鼠模型，来分析线粒体功能障碍与胰岛素抵抗及2型糖尿病的关系。在本研究中我们成功建立的两个品系的转基因小鼠：TRMU-knockdown和MRPL18-knockdown转基因小鼠品系，可用于下一步的研究工作，并可传代实现资源共享。相关研究成果正在整理投稿中，尚无标注本基金号的文章发表。.研究工作分为四个部分：1. TRMU-shRNA慢病毒表达载体的构建及在细胞水平研究；2. TRMU-knockdown转基因小鼠的构建及传代和表型分析；3. 肥胖大鼠肝脏线粒体蛋白组学研究；3. 低出生体重大鼠基因表达谱的研究及MRPL18-knockdown转基因小鼠的构建。.第一部分：成功构建了针对TRMU基因mRNA不同位点的 RNAi 慢病毒表达载体质粒，病毒包装后，感染 Min6 细胞后，可以高效抑制TRMU基因的表达，并影响了tRNA的稳定性。转染后细胞ROS浓度明显升高， Ca＋＋浓度降低。最后，通过胰岛素释放实验证明了RNAi 慢病毒感染 Min6 细胞后，胰岛素分泌水平明显受到了抑制。建立了线粒体功能障碍的β细胞系，可用于线粒体糖尿病发病分子机制的研究工作。.第二部分：通过向受精卵周隙注射慢病毒悬液获得2细胞期受精卵，将其回植入假孕母鼠体内，第一批获得3只阳性小鼠，在紫外光照射下可激发出绿色荧光，传代建立家系。该部分建立了转基因动物制作平台，实现了外源基因在小鼠体内的整合并得以在体内表达。另外，第二批的注射我们获得了转基因小鼠23只（17雄6雌）。.第三部分：建立高脂诱导胰岛素抵抗的大鼠模型。粗提肝脏线粒体蛋白，2-D分析找差异蛋白，挖取做MALDI -TOF质谱分析，然后Mascot软件分析，数据再KOG分类。最终确定24个差异蛋白，高脂组中显著上调的9个蛋白，显著下调的15个蛋白；KOG分类发现它们主要参与 生物代谢、细胞生命过程及信号转导等。.第四部分：通过母体妊娠期低蛋白饮食建立的低出生体重大鼠模型，子代出现追赶生长， 8月龄表现为肥胖、脂肪肝，血脂代谢异常，基因表达谱分析发现，与线粒体功能有关的基因发生变化，特别是MRPL18在肝，胰腺，肌肉表达显著下降。我们进一步建立了MRPL18敲低转基因小鼠。.另外，我们在人才培养方面，共培养5名硕士生。