猪牙髓干细胞-生物蛋白胶支架构建组织工程化牙髓牙本质复合体及机制研究

Construction of tissue engineered human dental pulp stem cells composite scaffolds for three-dimensional structure and research of tissue engineered dentin pulp complex regeneration, is currently an effective way for the treatment of dental pulp disease, also is difficulty to solve the international problem of research on regeneration of teeth at present. The project is based on the foundation of dental pulp stem cells and denta-l pulp stem cells can be differentiated to pulp dentin complex, according to the effects of rhBMP-2 factor and Notch signaling ligand Delta1 gene on dental pulp stem cell differentiation in vivo, we use the advantage of dental pulp stem cells and fibrin glue in three-dimensional structure model, using tissue engineering technology to explore the three-dimensional structure model of cell growth, innovative construction of dental pulp stem cells-biological fibrin glue bracket,study porcine dental pulp stem cells scaffold construction and in vivo porcine dentin pulp complex regeneration.This study can solve the low efficiency of key technical problems of the pulp tissue regeneration of three-dimensional structure and can provide the key parameters of clinically to construct tissue engineered dentin pulp complex for the repair of pulp tissue disease.

构建组织工程化牙髓干细胞复合支架三维结构及研究组织工程化牙髓牙本质复合体再生，是目前牙髓疾病治疗方法的研究热点，也是解决目前再生牙齿研究的瓶颈。本项目基于牙髓干细胞的发现以及牙髓干细胞可定向分化为牙髓牙本质复合体的理论研究基础，针对rhBMP-2 因子和Notch信号配体Delta-1基因对牙髓干细胞分化的影响，利用牙髓干细胞-生物蛋白胶三维立体结构模型的优点，采用组织工程技术探索细胞生长的三维立体结构模型，创新构建牙髓干细胞-生物蛋白胶支架，对猪牙髓干细胞支架的构建和猪体内牙髓牙本质复合体再生进行研究。本研究可解决目前牙髓牙本质复合体再生的三维立体支架结构效率低的关键技术问题，能为临床上构建组织工程化牙髓牙本质复合体以生物治疗牙髓组织疾病提供关键参数。

临床上由于牙髓感染导致的牙髓疾病是人类健康所面临的主要危害之一，最大限度恢复牙髓的生理状态和功能已成为口腔临床医生关注的热点。本研究我们首先采用传统的胰酶消化传代法成功分离并培养人牙髓干细胞和猪牙髓干细胞，并以流式细胞术和免疫荧光共聚焦图片检测牙髓干细胞表面标志物对其进行鉴定，可见CD34、CD45为阴性，CD146和STRO-1显示阳性，符合干细胞要求。在构建DPSC-生物蛋白胶支架的研究中，我们在倒置显微镜下观察生物蛋白胶中DPSC的生长情况及支架降解情况，显示凝胶呈半透明状，三维培养下细胞状态更加伸展，更加模拟自然生长，细胞状态良好，统计学分析表明胶原凝胶组与生物蛋白胶组细胞增长情况有统计学意义，说明了生物蛋白胶有很好的生物相容性。为了更进一步分析DPSC在生物蛋白胶支架中的分化情况，我们进行了矿化诱导实验，发现DPSC在生物蛋白胶支架中的矿化结节更大，这表明生物蛋白胶作为牙髓干细胞的支架材料是适宜的。我们还利用基因工程技术克隆Delta-1结构基因，成功构建了Delta-1基因真核表达载体，经脂质体转染质粒pcDNA3.1-Delta-1入牙髓干细胞，经Q-PCR和Western-blot检测，发现该基因上调表达提高了，目的基因具有很好的特异性，反应体系良好，而且随着rhBMP-2的溶度增加，牙髓干细胞发生分化的细胞数量更多，分化程度更高，MTT 结果显示，转染后DPSC 增值能力逐渐增强，而且添加rhBMP的DPSC 增值能力也是逐渐增强，但是至72小时后DPSC的细胞增值能力受到抑制。