基于高通量测序技术的膀胱癌尿路“核心菌群”特征解析及辅助诊断价值研究

As the application of high-throughput sequencing in microbiology is increasing in popularity, it has been proved that several kinds of bacterial colonies exist in urinary bladder and urine, which is called urinary microbiota. The core urinary microbiota and the association between bladder cancer and urinary microbiota structure changes have not been clarified yet. Previously, we have sequenced the 16S rDNA extracted from urine, bladder cancer tissues and paraneoplastic tissues. The results suggest that there is significant difference of bacterial diversity between the two tissues, and the urinary microbiota characteristics change in different pathologic stages. In our study, we will identify the major composition of the core urinary microbiota by the high-throughput sequencing technology and qPCR analysis. Then we will detect the influence of metabolites of urinary microbiota to FGFR3 and TP53 mutation. Lastly, we will explore the distributing characteristies of core urinary microbiota in the urine from healthy controls, papillary epithelioma patients and bladder cancer patients. We aim to evaluate the value of core urinary microbiota as biomarkers in bladder cancer diagnosis and to investigate the optimal panel of urinary combined detection in bladder cancer.

随着高通量测序技术在微生物领域的应用，已有多项研究证实膀胱及尿液中存在多种细菌，从而有学者提出膀胱尿路菌群这一崭新概念。膀胱癌发生发展与尿路菌群结构变化的关系及发挥主要作用“核心菌群”的组成目前尚未阐明。课题组前期对16例膀胱癌患者的尿液、癌及癌旁组织进行了16S rDNA扩增子测序，发现膀胱癌尿液中的菌群结构与健康人存在差异，癌与癌旁组织中菌群结构差异显著，不同病理阶段的尿路菌群特征也不同，对一些可能作为标志物的细菌进行了验证。本课题拟继续增加样本量，完善高通量测序数据，以期明确可能发挥主要作用的“核心菌群”的组成特征，并利用qPCR进行验证；随后选取“核心菌群”中2～4种可培养细菌，分析其及代谢产物对膀胱癌发生发展的关键基因 FGFR3、 TP53突变的影响；最后将通过qPCR分析健康人群和膀胱癌患者尿液中“核心菌群”的分布规律，评估其作为“标志性细菌”用于膀胱癌辅助诊断的价值。

微生物组又称菌群，是人体微环境的重要组成部分，主要分布在肠道、口腔、呼吸道、泌尿生殖道等器官中。菌群与机体存在共生的关系，其变化可在一定程度上影响着人体生理、病理功能的改变。近年来随着高通量测序技术的发展及细菌培养方式的改进，已有多项研究证实正常人尿道存在特定的微生物群落，且尿液菌群的改变与急迫性尿失禁、膀胱过度活动症和前列腺癌等多种泌尿系统疾病相关。膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率，严重危害人类健康。迄今为止，很少有学者对膀胱癌相关尿路菌群进行系统研究。本项目首先通过对膀胱癌/癌旁组织和新插尿管尿液标本进行了高通量16S rDNA测序，展开生物信息学的数据挖掘，发现膀胱组织菌群的多样性及丰度在癌及癌旁组织中存在差异，膀胱癌患者尿液与对照组也存在差异。利用荧光原位杂交技术（FISH）对膀胱癌与癌旁组织中的菌群进行定位分析，从组织学层面进一步证实了膀胱菌群的存在。同时，积极探索尿液培养组学的新方法，采用增强定量尿液培养方案（EQUC）对膀胱癌患者尿液进行增强培养，结合尿液的测序数据分析挖掘出腐生葡萄球菌、大肠埃希菌和脆弱拟杆菌等可培养的差异菌株。对可培养的膀胱癌“差异细菌”与膀胱癌细胞/膀胱上皮细胞进行共培养，成功构建腐生葡萄球菌、大肠埃希菌和脆弱拟杆菌等差异细菌与T24和 SV-HUC-1细胞的共培养模型，发现差异细菌对膀胱细胞的生物学功能产生一定影响。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术，建立了尿路病原菌的直接鉴定与快速药敏新方法，显著缩短了尿液病原菌的鉴定和药敏时间。