瑞士乳杆菌MB2-1源抗艰难梭菌粘附胞外多糖（EPS）的控制性合成、活性筛选及其作用机制研究

Clostridium difficile is recognized as the most important causes of infection and antibiotic associated diarrhea. The adhesion of which to intestinal mucosal surface is the premise condition of further colonization incidence, which led to rising in both morbidity and mortality recent years. Traditional antibiotic treatments have disadvantages such as drug resistances and recurrent diseases. Therefore, replacement of using micro ecological therapy has raised many interests. During our previous study, Lactobacillus helveticus MB2-1, a strain isolated from traditional Sayram yogurt from Xinjiang province showed a high yield of exopolysaccharides (EPS), and possess potent anti-adhesion effects against Clostridium difficile. This project is proposed to establish a target oriented controlled synthesis of EPS based on genomics and proteomics, to construct Lactobacillus helveticus MB2-1 derived typical EPS containing feature active units against Clostridium difficile, to screen pure EPS fractions with potent activities, and finally, study the structure-activity relationship between the EPS fractions and the anti-adhesion effects in qualitative, quantitative and site-oriented manners. This project is considered to provide solid theoretical and applicative bases for the development of dairy products with anti-Clostridium difficile effects.

艰难梭菌是公认的医院内感染和抗生素相关性腹泻最重要因素，近年来发病率和死亡率不断攀升。艰难梭菌粘附于肠黏膜表面是其进一步定植发病的前提条件，传统抗生素治疗存在易产耐药性和病情易反复等问题，因此微生态等替代疗法渐成研究热点。本课题组在前期研究中从药食兼用型传统新疆赛里木酸奶中分离到一株高产胞外多糖（EPS）的瑞士乳杆菌MB2-1，该菌产EPS具有很强抗艰难梭菌粘附活性。本项目拟建立基于基因组学和蛋白质组学的瑞士乳杆菌MB2-1 EPS控制性合成方法，构建含抗艰难梭菌特征活性结构单元的瑞士乳杆菌MB2-1源EPS组分库，明确各EPS组分与艰难梭菌的亲合能力以及特定毒素的结合能力，筛选得到高效、专一的EPS组分，并定性、定位、定量探讨各EPS组分抗艰难梭菌粘附作用构效关系及其内在作用机制。为乳酸菌EPS以及功能性抗C. difficile乳制品的深层次开发和利用提供坚实的理论和应用基础。

艰难梭菌（Clostridium difficile）是公认的医院内感染和抗生素相关性腹泻最重要因素，近年来发病率和死亡率不断攀升。艰难梭菌粘附于肠黏膜表面是其进一步定植发病的前提条件，传统抗生素治疗存在易产耐药性和病情易反复等问题，因此微生态等替代疗法渐成研究热点。在前期研究中从药食兼用型传统新疆赛里木酸奶中分离到一株高产胞外多糖（EPS）的瑞士乳杆菌MB2-1（Lactobacillus helveticus MB2-1），该菌产EPS具有很强抗艰难梭菌粘附活性。本项目建立了瑞士乳杆菌MB2-1 EPS的控制性合成方法，进而对瑞士乳杆菌MB2-1产胞外肽聚糖（PGN）和胞外粘液多糖（r-EPS）进行了分离提取条件优化和结构分析，获得了其一级结构和高级结构信息，通过改变外源碳源种类和控制发酵条件，获得多种含特征活性结构单元的EPS组份；在此基础上还对从拉丝酸奶中分离到的另一株德氏乳杆菌保加利亚亚种SRFM-1（L. delbrueckii ssp. bulgaricus SRFM-1）中产EPS进行了纯化和结构分析，构建了结构丰富的EPS组份库；进一步对不同EPS纯组分抗高毒力艰难梭菌027等致病菌粘附及生物膜清除活性进行了研究，建立了一种新型的基于APEX2酶催化的生物标记方法，通过构建多种质粒进行转染，对艰难梭菌027产tcdA和tcdB毒素作用靶细胞机制及不同EPS组分对毒素结合能力影响进行了研究。结果表明瑞士乳杆菌MB2-1源EPS纯组分对于两种毒素对于内质网上相关蛋白的分泌和表达，具有干扰作用，TcdA毒素可能通过内质网内膜CROP结构域与毒素结合，而且还与内吞作用相关。研究过程中同时发现不同碳源对瑞士乳杆菌MB2-1发酵产EPS的结构和病原菌生物膜清除活性也具有显著影响，而且除瑞士乳杆菌之外，包括德氏乳杆菌保加利亚亚种在内其他类型乳酸菌源EPS也对艰难梭菌等致病菌具有一定抑制作用，这可能与乳酸菌源EPS的一些共有活性结构位点有关。最后为了进一步对瑞士乳杆菌MB2-1产EPS进行深入研究和合成预测，又对该菌株的全基因组及比较基因组进行了分析。该项目研究结果可为乳酸菌EPS以及功能性抗艰难梭菌乳制品的深层次开发和利用提供一定的的理论和实践基础。