核小体结构的组装动力学:单分子磁镊技术的新探索

Nucleosome is the basic structure of eukaryotic chromatin. The dynamics of nucleosome assembly and disassembly have important effects on higher level structures of chromatin. Although the nucleosome high resolution static structure has been resolved, the dynamics of nucleosome assembly and disassembly are unclear.To investigate this nucleosome dynamics,we first design new DNA samples which can combine two micro-beads. And we will record the length and rotation of DNA simultaneously by magnetic tweezers, which will show the structure changes of nuclesome in details and help us judge the status of combination between DNA and histones. The experiments will assit us to answer two critical questions about nucleosome. The first question is what is the dynamical path of nucleosome assembly and disassembly. The second one is what is the effects of DNA twist on nucleosome's structure. Based on these studies, we will check the stability of nuclsome for different histone variants, the chemical modification of DNA and histones,the nucleosome factors such as NAP1 and ACF. The investigation of dynamics of nucleosome assembly and disassembly will help us to understand the structure of nucleosome, three-dimention genome and the process of DNA replication and transcription.

核小体是真核细胞染色体结构第一个重要的结构层次，其组装和拆解的动力学路径直接影响染色体的整体结构。目前高精度的核小体静态结构已经解析出，但其结构形成的动力学机制还不清楚，亟待实验提供直接的证据。本项目中，我们将设计制备可连接两个微球的DNA样品，利用高分辨率的磁镊单分子设备，并结合单分子荧光技术和原子力显微镜，实时测量核小体动态组装和拆解过程中DNA长度和转动的变化。这样的实验方案能够分辨出核小体动态结构的细微变化，帮助我们回答核小体领域中两个关键的问题：（1）核小体组装和拆解的动力学路径；（2）DNA的扭力对核小体以及核小体链的影响。在此基础上，我们将系统研究组蛋白的不同变体、DNA和组蛋白的化学修饰、核小体辅助因子以及重构因子等因素对核小体结构稳定性影响。本项目的开展对理解核小体的组装和拆解,染色体三维高级结构，以及DNA复制、转录等生命过程有着积极重要的意义。

在真核生命中，核小体是染色质结构单元，其动态结构和相关调控的研究是理解染色质功能的关键。在本项目中，我们主要利用磁镊单分子力谱技术系统研究了核小体的折叠动力学，揭示了连接组蛋白H1在增强核小体结构稳定性方便面发挥的重要功能。连接组蛋白H1位于核小体的DNA出入口附近，通过主动拆解H1核小体，我们发现，相对于不带H1的核小体，打开H1核小体的外圈所需要的外力从2pN附近增加到10pN附近。核小体结构对转录机器Pol II而言是个严重的结构障碍，需要转录辅助因子FACT的参与才能保证转录机器顺利的通过核小体完成基因的转录。我们利用磁镊单分子力谱技术，揭示了转录辅助因子FACT对核小体结构的调控，发现FACT对核小体具备双重的调控作用，首先FACT结合核小体后，降低核小体的结构稳定性，使得核小体在小于10pN的外力下完全打开。其次，FACT能够在核小体结构被外力破坏后帮助核小体结构恢复到完整核小体的状态，FACT具备保持核小体结构完整性的重要的功能。另外，我们进一步研究了染色质纤维的折叠动力学，首次在体外揭示了染色质纤维中四聚核小体单元的动态折叠过程，同时也发现了转录辅助因子FACT对染色质纤维结构的动态调控功能。本项目课题的开展，使得核小体动态结构的图像有了更将清楚的揭示，尤其是揭示了H1和FACT这些功能性蛋白对核小体动态结构的影响和调控。这些成果，为后面开展基因转录动态过程，以及药物分子对核小体和染色质纤维的影响奠定了基础。除此之外，在本项目中，我们发展了磁镊单分子力谱技术，实现了高通量高分辨的实验测量。