桔梗皂苷D对2型糖尿病小鼠降血糖作用及肝脏糖异生的分子调控机制

AMP-Activated protein kinase (AMPK), an energy sensor that regulates cellular metabolism, has been reported to be involved in the glucose metabolism of various key tissues such as liver, skeletal muscle, adipose tissues, and pancreatic β cells in the pathogenesis of T2DM. Previous findings showed that AMPK plays a key role in the control of hepatic metabolism. Therefore, AMPK could control blood glucose levels by inhibiting hepatic glucose production..Our results indicated hypoglycemic effect of crude saponins from Platycodon grandiflorm on type 2 diabetes mice. We hypothesized that platycodins exhibited hypoglycemic activity via activation of AMPK and suppression of hepatic gluconeogenesis. In this work, based on the above findings, platycodin D (a major triterpenoid-type saponins in P. grandiflorm) was employed to investigate hypoglycemic effect of type 2 diabetes mice in order to explore the regulation mechanism on AMPK/PEPCK/G-6-Pase signal passageway of hepatic gluconeogenesis. These expect results will supply theory basis for utilizing platycodins and P. grandiflorum as new supplementary treatment agency for type 2 diabetes.

研究表明：激活AMPK活性，抑制肝脏过度糖异生(gluconeogenesis)，减少内源性葡萄糖生成，是治疗2型糖尿病的重要靶标之一。据报道：桔梗皂苷通过激活AMPK活性而能够预防酒精性大鼠脂肪肝和氧化应激损伤。我们研究亦发现：桔梗皂苷具有明显的降血糖作用，可以改善葡萄糖耐量，增加肝糖原含量。因此，我们推测：肝脏是桔梗皂苷发挥生物活性的重要靶器官之一，桔梗皂苷可能通过激活肝脏AMPK活性，抑制肝糖异生信号通路而发挥降血糖作用。.本项目基于大量的前期研究工作及桔梗皂苷的降血糖作用。为进一步阐明桔梗皂苷的降血糖分子调控机理，拟以桔梗皂苷中的代表化合物-桔梗皂苷D（platycodin D, PD）为研究对象，观察其对高脂饮食联合STZ诱导的2型糖尿病小鼠的降血糖作用，结合HepG2细胞糖生成实验，在动物和细胞水平阐释桔梗皂苷D对AMPK/PEPCK/G-6-Pase肝糖异生信号通路中的调控。

2型糖尿病发生时，肝糖异生关键酶PEPCK和G-6-Pase表达异常增高，显著抑制二者的表达水平可有效控制空腹血糖。此外，激活AMPK可以减少肝糖异生的PEPCK和G6Pase两个关键酶的表达。因此，激活AMPK减少肝糖异生的PEPCK和G6Pase两个关键酶的表达已成为抑制2型糖尿病肝糖异生的重要靶标之一。.课题组前期研究已经证明：桔梗总皂苷可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖，改善肝功能。桔梗皂苷D是桔梗中的主要三萜皂苷，含量高，易获得，以桔梗皂苷D为研究对象开展降血糖活性及其糖异生分子调控研究具有理论和实际可行性。.通过项目实施，我们取得了如下结果：.1、文献整理：经查阅大量文献，对桔梗皂苷类成分的药理活性进行了仔细的文献梳理工作，整理了三萜皂苷在糖脂代谢调控方面的文献。.2、桔梗总皂苷的制备：取鲜桔梗80斤，乙醇冷浸数天，超声波提取3次，每次1小时，合并滤液，减压浓缩至干，用水混悬，上D101大孔树脂柱，水洗脱去杂质，40%乙醇冲洗收集皂苷部分，即得桔梗总皂苷，HPLC分析显示，该总皂苷富含桔梗皂苷D等皂苷类成分。.3、利用蜗牛酶转化桔梗总皂苷：利用蜗牛酶转化桔梗总皂苷制备桔梗皂苷D，转化率大于80%，优化了制备工艺参数。.4、桔梗皂苷D的分离及结构鉴定：对酶转化后的桔梗皂苷，利用传统硅胶柱色谱分离，结合半制备HPLC，得到桔梗皂苷D单体，经HPLC检测，纯度》98%，850mg，结构鉴定显示与标准品一致。.5、桔梗皂苷D对2型糖尿病小鼠的降血糖作用：建立STZ联合HFD致2型糖尿病小鼠模型，给予桔梗皂苷D，结果表明：桔梗皂苷能够有效降低2型糖尿病小鼠空腹血糖，改善胰岛素抵抗和口服糖耐量，并能降低血清中TG和TC水平。Western blot分析表明，桔梗皂苷D能够激活肝脏中AMPK活性，并抑制PEPCK和G6Pase蛋白表达水平。.6、桔梗皂苷D对HepG2基础糖生成检测：MTT研究表明，桔梗皂苷D《10uM时对HepG2细胞未表现细胞毒性，在2.5,5和10uM浓度下呈剂量依赖抑制葡萄糖糖生成，且能够激活AMPK活性，抑制PEPCK和G6Pase蛋白表达水平。.7、桔梗皂苷D的体内抗酒精肝损伤活性：桔梗皂苷D能有效改善酒精诱导的急性肝损伤。.综上述，本课题的实施为深入开发桔梗皂苷D的降血糖活性提供了理论参考，为桔梗这一药食同源植物的深入开发提供理论支撑。