马奶酒样乳杆菌基因组分析及其胞外多糖合成关键基因的研究

目前，过量增稠剂和稳定剂的添加已经影响我国发酵乳制品的口感及安全性，而国外同类产品则多以产粘乳酸菌的胞外多糖特性来赋予发酵乳制品粘度和稳定性，从而保证产品的口感和质量。因此，对产胞外多糖乳酸菌的研究和开发十分必要。本研究以实验室自行分离得到的一株具有产粘特性的、与普通酸奶发酵剂具有协同作用的、源于西藏传统发酵乳制品Kefir的马奶酒样乳杆菌ZW3为研究对象，对其胞外多糖合成的分子机理及代谢调控进行研究，包括对ZW3菌株进行高通量随机全基因组测序。通过对测序结果分析，研究胞外多糖生物合成关键基因的特性及其转录翻译过程与多糖积累之间的相关性，构建ZW3胞外多糖合成基因网络。利用基因工程及代谢工程手段，过量表达磷酸葡萄糖变位酶和焦磷酸化酶等多糖合成关键酶，以提高胞外多糖产量，进一步揭示马奶酒样乳杆菌ZW3胞外多糖合成的途径及其关键基因的作用。

本研究以实验室自行分离得到的一株具有产粘特性的、与普通酸奶发酵剂具有协同作用的、源于西藏传统发酵乳制品Kefir的马奶酒样乳杆菌ZW3为研究对象，对其胞外多糖合成的分子机理及代谢调控进行研究。本研究完成了马奶酒样乳杆菌ZW3的全基因组测序，并绘制了其基因组序列图谱。全基因组测序得到的测序结果进行分析，该菌株包含一个2,113,023bp的环状染色体（CP002764）以及两个大小分别为194,769 bp (pWW1，CP002765)和46,296 bp (pWW2，CP002766)的质粒，染色体的GC含量为37.70%，含有1,908个蛋白编码序列(CDSs)，60个tRNA编码基因，4个rRNA编码基因。质粒pWW1的GC含量为33.98%，含有199个CDSs；质粒pWW2的GC含量为36.02%，含有55个CDSs。基因组数据分析表明，该菌基因组中含有9个IS插入序列，18个与糖类相关的PTS型糖类转运蛋白，14种完整的具有潜在功能PTS基因复合体。该菌染色体上含有一段14.4 kb的胞外多糖合成相关基因簇(WANG_1283–WANG_1299)，含有17个多糖编码相关基因。通过对多糖合成基因簇及糖代谢途径中的基因的转录情况和在大肠杆菌和乳酸乳球菌中的表达情况进行分析，确定了影响胞外多糖合成的部分关键基因，并对其进行了功能研究。结果表明：WANG_0963、WANG_1286、WANG_1291、WANG_1296、WANG_1297等基因在ZW3胞外多糖的合成中发挥着重要作用。WANG_1297基因在胞外多糖链的延伸、聚合阶段起作用；WANG_1286与胞外多糖聚合输出功能相关，该基因进行异源表达能显著提高目的菌株胞外多糖产量；WANG_1296基因与酪氨酸蛋白磷酸酶同源性较高，并且对胞外多糖的合成起促进作用；WANG_1291的产物将半乳糖乙酰化生产O-乙酰半乳糖，具有O-乙酰转移酶活性；在菌株ZW3中，对葡萄糖代谢的关键酶α-葡萄糖磷酸变位酶基因pgm2（WANG_0963）进行了过表达，使胞外多糖产量提高了20.16%；研究表明，ZW3中存在两种类型的乳糖酶—LacZ和LacLM，两种乳糖酶均具有双重催化作用但活性存在差异，既能水解乳糖为葡萄糖和半乳糖，又能催化半乳糖合成低聚半乳糖。