自噬在两种蛋白酶体抑制剂诱导的帕金森病细胞模型中的作用及机制研究

自噬-溶酶体途径(ALP)降解细胞内错误折叠和异常损伤的蛋白和细胞器，与泛素-蛋白酶体途径(UPS)一起维持细胞内环境的稳定。UPS受抑已被公认参与帕金森病（PD）发病，近来的研究发现ALP功能异常在其中也有作用。有证据显示，UPS受抑制时，ALP被活化，但具体过程不详。本研究拟关注如下问题：蛋白酶体受抑后，自噬如何被启动？途径如何？自噬的作用如何？蛋白酶体活性和自噬活化之间的代偿关系如何？本课题组前期的研究显示抑制PC12细胞的蛋白酶体功能，细胞内出现自噬体。基于此，本研究拟用两种不同原理的蛋白酶体抑制剂诱导PD细胞模型，应用电镜、蛋白质组学、细胞免疫化学、激光共聚焦显微镜、荧光染色、生物化学及基因敲除等多种手段，探索自噬在蛋白酶体抑制剂诱导的PD模型中的作用及机制，发现关键蛋白。通过不同途径增强自噬对此模型的影响及机制，分析自噬在蛋白酶体抑制剂诱导的PD细胞模型中的作用，寻找可能的药物

自噬-溶酶体途径(ALP)降解细胞内错误折叠和异常损伤的蛋白和细胞器，与泛素-蛋白酶体途径(UPS)一起构成了细胞内的蛋白质降解系统，协同作用，维持细胞内环境的稳定。UPS受抑及ALP功能异常均已被证实参与帕金森病（PD）的发病，但二者之间的相互作用及相互关系并不清楚。本研究关注了如下问题：蛋白酶体受到抑制后，自噬的启动活化时间、程度和途径；自噬活化过程中的关键蛋白质有哪些；蛋白酶体活性和自噬活化之间的代偿关系如何？自噬增强后能否弥补蛋白酶体抑制带来的损伤，进而有希望成为PD治疗的药物。本研究的结果如下：25nM PSI抑制PC12细胞的蛋白酶体活性后，自噬2小时时开始活化，4小时，细胞内出现α-synuclein阳性的包涵体，12小时时明显，而自噬活性到12小时最高，到24小时时自噬活化程度减低。2.5μM lactacystin作用于PC12细胞，自噬在2h后开始活化，4小时时，α-synuclein阳性包涵体开始比较明显， 8h达到峰值，12h开始逐渐减弱，到24小时时，几乎所有的细胞胞浆内均出现了α-synuclein阳性聚集的包涵体。通过ATG12的途径被启动其后，随时间延长，损伤进一步加重，导致细胞出现凋亡及细胞内包涵体，细胞存活率下降，细胞大量死亡。通过基因敲除的结果显示，PSI活化自噬是通过ATG12的途径。10μM lactacystin作用PC12细胞24h，进行差异蛋白质组学研究，鉴定了6个差异表达蛋白，分别是 表达增加的Hsc70、GRP78、SERPINB6、AR和表达减少的peripherin 和TH，进而western blot 验证了这些蛋白质组学变化，这些蛋白质的的表达变化体现了蛋白酶体对细胞的损伤，同时显示了细胞的可能应激反应。在给予细胞蛋白酶体抑制剂的同时给予自噬增强剂，无法阻止细胞凋亡和包涵体的出现，提前给予自噬刺激剂可能是有效地预防蛋白酶体抑制剂相关损害的手段。本研究探索了自噬在蛋白酶体抑制剂诱导细胞损伤中起补偿作用，通过ATG12的途径，发现该过程中的数个关键蛋白，揭示了自噬增强剂作为PD治疗的药物的潜力及应用时机，为PD的病因和机理的进一步研究提供了线索和方向，为自噬增强剂成为PD治疗的可能药物提供了证据。本研究已经发表SCI论文3篇，超额完成研究任务。