秦岭“太白七药”内生菌多样性及其功能菌株筛选

重视药用植物内生菌的研究，实现用内生菌代替药用植物生产活性物质，具有重要的生态和经济学意义。"太白七药"是秦岭主峰太白山最具特色的药材资源，品种众多，药理作用广泛，具有广阔的应用前景。本项目拟从太白山采集"太白七药"的根，茎，叶等植物组织，分离其内生真菌、细菌和放线菌，通过表型特征和分子生物学等手段进行鉴定，然后筛选其中具有抗菌、抗肿瘤活性的功能菌株，通过聚酮合酶(PKS)基因和非核糖体肽合成酶(NRPS)基因通用引物对功能菌株基因组聚酮类和非核糖体肽类生物合成功能基因进行分子筛选，通过薄层层析和高效液相色谱等手段进行内生菌活性成分的初步检测。通过以上研究，不仅可以揭示"太白七药"内生菌的生物多样性，而且可以获得一批有特定功能和潜在应用价值的微生物资源，为今后功能菌株活性成分的结构鉴定，菌种遗传改造，发酵条件优化，以至最终实现工业化生产奠定基础。

项目实施期间，从秦岭太白山采集10余种“太白七药”药用植物组织，采用2种细菌培养基和5种放线菌培养基从其根、茎和叶片中分离纯化500多株内生细菌和300多株内生放线菌并保藏，为后继研究积累了丰富的实验材料。通过表型特征和16S rRNA基因序列分析对分离自拐枣七、偏头七、盘龙七、追风七、狗头三七和桃儿七六种太白七药的内生菌株进行了初步鉴定，并对其中11株潜在新分类单元进行细致的多相分类研究，其中1个细菌新属，6个细菌新种已经发表在国际权威系统分类学期刊Int J Syst Evol Microbiol和Antonie van Leeuwenhoek上。选取7种植物病原真菌（小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麦全蚀病菌和小麦纹枯病菌）与4种细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和铜绿假单胞菌）作为指示菌，对分离自拐枣七、偏头七、盘龙七、追风七、狗头三七和桃儿七的345株内生细菌和150余株放线菌菌株进行抗菌活性筛选，发现具有较强抑菌活性的内生细菌56株，内生放线菌28株。随后，利用聚酮合酶(PKS)基因和非核糖体肽合成酶(NRPS)基因通用引物对活性菌株基因组聚酮类和非核糖体肽类生物合成基因进行分子筛选，通过克隆与测序，从16个内生细菌菌株中获得了11个PKS基因片段和7个NRPS基因片段(2株内生细菌同时检测到PKS和NRPS基因片段)，所有序列全部上传NCBI数据库（PKS基因序列NCBI登录号为KF539768-KF539778；NRPS基因序列NCBI登录号为KF539779-KF539785）。然后，从中挑选具有较强抑菌活性的Pseudomonas属菌株GZJR-8进行基因组精细图测序、组装、注释及相关分析，从中发现多种促生抗逆基因（ACC 脱氨酶基因、非核糖体肽类铁载体合成基因簇等）以及生防相关活性物质（phenazine, hydrogen cyanide, pyocin, colicin, microcin等）的编码基因或基因簇。此外，挑选了1株对植物病原真菌有极强效果的Streptomyces属内生放线菌株ZFGIS-1，对其活性产物进行了初步分析，发现其代谢产物中含有萜类、生物碱和酰胺类等化合物。在基金资助下以项目负责人为第一作者或通讯作者发表研究论文12篇，其中SCI收录论文11篇，累计影响因子超过27。