CRISPR/Cas系统定位修复血友病A外周血来源的iPSCs基因缺陷的研究

Hemophilia A is an X-linked hereditary hemorrhagic disease which is caused by defective synthesis of factor FVIII.Genetic therapy is the most hopeful way to cure hemophilia. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) technique can obtain patients' stem cells of their own genetic background and the CRISPR/Cas9 system is a good tool for genetic repair in fixed positions in an efficient way. So the genetic therapy of hemophilia A by the combination of the iPSCs technique and the CRISPR/Cas9 technique has good feasibility and prospect for clinical application. Our research will firstly establish the iPSCs lines from the peripheral blood of hemophilia A and then use the CRISPR/Cas9 technique to repair the defected FVIII gene of the iPSCs in fixed position, and then differentiate the repaired iPSCs to hepatic endothelial cells. We will detect their ability of generating FVIII and the activity of FVIII. Then transplant the hepatic endothelial cells to the liver of immunodeficiency mice and detect its ability of generating human FVIII. This study use the CRISPR/Cas9 technique and the iPSCs technique to research the genetic therapy of hemophilia A, which will provide theoretical basis and technical support to the clinical genetic therapy of inherited genetic defective diseases.

血友病A是X染色体连锁的凝血因子VIII (FVIII)基因缺陷所致的遗传性出血性疾病，最有希望治愈血友病的途径是基因治疗。诱导多能干细胞（iPSCs）技术可以获得具有自身遗传背景的多潜能干细胞，而CRISPR/Cas9系统可以进行高效的定点基因缺陷修复，因此iPSCs技术联合CRISPR/Cas9技术进行血友病A基因治疗的研究具有良好的可行性和临床应用前景。本研究首先建立血友病A患者外周血来源的iPSCs，拟用CRISPR/Cas9技术对患者iPSCs的缺陷FVIII基因进行定点修复，将修复后的iPSCs定向分化为肝内皮细胞，检测其生成FVIII的能力和活性，并移植到免疫缺陷小鼠肝脏中检测产生人源性FVIII的能力。本研究使用iPSCs技术联合CRISPR/Cas9技术来研究血友病A基因定点修复治疗，为遗传性基因缺陷性疾病的临床基因治疗提供理论依据和技术支持。

背景：血友病是X染色体连锁隐性遗传性出血性疾病，只有基因治疗能从根本上治愈血友病。.目的：对血友病A家系和血友病B家系中的血友病患者和女性携带者采用高通量测序的方法进行凝血因子F8和F9的测序。建立血友病A、血友病B和正常人外周血单个核细胞来源的iPS细胞系。采用CRISPR/Cas9系统将F9 cDNA插入血友病B患者iPSCs的AAVS1位点，并将插入后的iPSCs定向分化为肝细胞，后将其植入NOD/SCID小鼠中，检测人源性肝细胞的植入。.方法：（1）收集血友病A家系和血友病B家系的血友病患者和女性携带者；（2）设计捕获阵列来捕获F8和F9基因的所有外显子，剪接位点，与相邻的内含子序列，进行高通量测序；（3）分离血友病患者和正常人的外周血单个核细胞，建立患者和正常人的iPS细胞系；（4）iPS细胞系的鉴定；（5）构建AAVS1-Cas9n质粒和AAVS1-F9-Donor质粒，电转血友病B患者iPSCs，药筛得到阳性克隆；（6）将插入F9 cDNA的iPSCs定向分化为肝细胞；（7）体内实验检测人源性肝细胞的植入。.结果：（1）在血友病A家系，共发现8例内含子22倒位，1例内含子1倒位，9例错义突变，3例无义突变，2例大片段缺失，1例小片段缺失，1例小片段插入，2例小片段缺失伴插入和2例剪接突变。在血友病B家系，共发现9例错义突变，2例无义突变。（2）共建立5例血友病A、7例血友病B和3例正常人的iPS细胞系，染色体核型均正确，多能性经鉴定良好。（3）共获得4个在AAVS1位点纯合插入F9的iPS克隆，32个在AAVS1位点杂合插入F9的iPS克隆。（4）将插入F9 cDNA的iPSCs分化为的肝细胞可以分泌AFP和ALB，具有糖原储存功能、吲哚菁绿和LDL摄取功能。发生knock-in的iPS克隆分化来的肝细胞培养上清中FIX的凝血活性高于对照组，两组间有显著性差异。（5）所分化的肝细胞可以在NOD/SCID小鼠中植入。.结论：高通量测序可以用于血友病的诊断；使用episomal的方法可以建立血友病患者外周血来源的iPS细胞系； CRISPR/Cas9系统构建简单，切割效率高；由iPSCs分化来的肝细胞具有成熟肝细胞的功能，且能在NOD/SCID小鼠中植入。