SFTSV膜蛋白B/T细胞表位联合多抗原肽的免疫保护作用及机制研究

Severe fever with thrombocytopenia syndrome (SFTS) is a serious emerging infectious disease, the major symptoms of which include fever, thrombocytopenia, leukocytopenia and multiorgan dysfunction. In order to enhance the control and prevention of the SFTS disease, the vaccine specific for SFTSV protection is eagerly needed to be developed. For the control and prevention of infectious diseases, multiple antigen peptide (MAP) based vaccine is one of the most important research areas for novel vaccine development. Recent researches confirmed that the membrane proteins Gn/Gc play important role during the adhesion and invasion of the SFTSV to the host cells. These two viral surface glycol-proteins are the sole targets for neutralizing antibodies, which provide the important target for MAP vaccine designation. In this study, bioinformatic analysis will firstly be performed on the Gn/Gc proteins. Phage display technique will be used to express and purification of the predicted B/T cell epitopes. Liquid Chip and Surface Plasmon Resonance detection platform will be applied for the dominate line B cell epitope selection and identification. T cell proliferation, differentiation and cytokine secretion detection assay will be used for the T cell epitope selection and identification. Based on the selection study of predominate B/T cell epitopes, MAP will be synthesized and further applied for the immuno protection analysis by the SFTSV neutralization and animal protection test. The study of this project will provide the antigen candidates for the SFTSV specific MAP vaccine development. This original study shows high academic value, and the results of which show extensive application prospect.

发热伴血小板减少综合征(SFTS)是由一种新型布尼亚病毒(SFTSV)感染引起的急性传染病。最新研究发现SFTSV膜蛋白Gn/Gc是SFTSV中和抗体唯一识别单位，但Gn/Gc蛋白的免疫保护作用和机制不明。本项目拟通过对SFTSV膜蛋白Gn/Gc进行抗原表位预测，采用噬菌体展示技术对目的线性B/T细胞抗原表位多肽进行表达纯化；基于悬浮芯片和表面等离子共振检测技术，筛选和鉴定Gn/Gc特异性优势线性B细胞抗原表位；基于抗原肽刺激T细胞增殖、分化、细胞因子分泌实验检测技术，筛选和鉴定Gn/Gc特异性优势T细胞抗原表位；以多聚赖氨酸作为核心，通过化学合成方法制备基于优势线性B/T细胞抗原表位的分支状联合多抗原肽（MAP）；通过病毒中和试验和动物保护试验证实联合MAP的免疫保护作用和分子机制；以期为SFTSV特异性保护疫苗研制提供候选抗原，具有重要的学术价值和广泛的应用前景。

发热伴血小板减少综合征病毒（sever fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV）感染人体可引起发热伴血小板减少综合征。该新发传染病以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损伤为主要临床症状。SFTSV感染者往往急性起病且死亡率高，但目前未有特异性治疗药物。通过SFTSV疫苗研制，以期为易感人群提供免疫保护，已成为公认的SFTSV感染防制有效手段。.本研究通过采用荧光定量RT-PCR技术进行SFTS病例监测。研究团队在浙江省发现并鉴定了SFTSV首例感染病例。我们通过建立SFTSV细胞感染模型并采用病毒分离培养技术获得SFTSV纯化毒株。通过SFTSV感染监测，研究期间共发现51个SFTSV感染阳性病例，病死率为12％（6/51）， 92％的患者（47/51）超过50岁，63％（32/51）SFTSV感染确诊病例发生在5-7月。同时，我们采用全基因组测序技术对SFTSV基因组序列进行检测并完成SFTSV的分子进化研究。SFTSV的分子进化规律和外膜蛋白Gn/Gc的序列保守性得到系统分析。基于SFTSV分子进化分析研究结果，我们通过采用生物信息学技术对外膜蛋白Gn/Gc的结构分析，成功完成该蛋白潜在B/T细胞线性表位结构预测，并获得相关线性表位的多肽氨基酸序列，其中共发现28个B细胞线性抗原表位和10个T细胞线性抗原表位。通过化学合成获得纯化蛋白多肽并采用高效液相色谱法偶联质谱检测技术完成多肽纯度鉴定。通过将多肽蛋白标记于表面等离子共振检测芯片上，以SFTSV特异性抗体为流动相，发现5个SFTSV抗体特异性优势B细胞线性抗原表位。通过T细胞刺激和检测分析，证实了3个T细胞线性抗原表位。以多肽蛋白和灭活SFTSV全病毒免疫家兔获得兔抗血清，并基于SFTSV细胞感染模型完成多肽的免疫保护作用评价研究，证实所筛选的多肽抗原可诱导SFTSV保护性抗体产生，具有免疫保护作用。.本研究阐明了SFTSV在疫源地的流行区域、人群分布和季节特征，为SFTSV感染的防制提供了重要依据。通过全基因组测序和生物信息学分析，阐明SFSTV的分子进化特征。同时，通过优势B/T细胞线性表位预测筛选和鉴定，获得SFTSV外膜蛋白中的优势线性表位多肽，为SFTSV保护性疫苗研制提供重要的候选抗原。