基于新型体外胎盘屏障模型的HBV宫内传播机理研究

随着乙肝疫苗的普及应用，乙型肝炎病毒(HBV)的水平传播已经得到了明显的控制，但对HBV宫内传播却缺乏有效的预防措施，宫内传播必将是未来HBV流行的主要途径。我们既往研究表明，维系母亲与胎儿的纽带-胎盘组织，尤其是滋养层细胞对不同HBV基因特征株的选择性通过和启动先天性免疫，与发生HBV宫内感染起着关键作用。本课题拟基于HBV宫内感染队列的病毒学资料和新生儿HBV感染情况等随访调查结果，研究发生宫内感染的HBV病毒基因特征，探索HBV宫内感染和病毒变异之间规律；并以我们自主培养的一株永生化人早孕滋养细胞构建新型体外胎盘屏障模型（PCB-HPT），再以滋养层细胞上Toll样受体中TLR9为切入点，应用RNA干扰技术，探索滋养层细胞中TLR9在胎盘滋养细胞针对不同HBV基因特征株所诱导的免疫应答差异，以期阐明HBV宫内感染的免疫机制，为控制HBV宫内传播提供依据。

本项目从宏观人群研究和微观体外胎盘屏障模型研究着手，探讨了HBV宫内传播发生的相关因素。主要结果有：①首次建立和鉴定新型体外胎盘屏障研究模型PCB-HPT模型，完整屏障模型维持时间可达24~36h，屏障模型具有完整性和极化性。②首次建立TLR9基因抑制的PCB-HPT模型，屏障模型可维持12~16小时，屏障模型具有完整性和极化性。③基于胎盘屏障模型的HBV感染试验发现：HBV高滴度病毒攻击12小时可进入胎盘屏障的第一层细胞-滋养细胞，屏障在受病毒攻击后存在完整性被破坏的现象。④TLR 9在宫内传播中作用的研究发现：正常胎盘组织中TLR 9仅表达于滋养细胞，HBsAg阳性产妇胎盘组织中的滋养层细胞、间质细胞和绒毛毛细血管内皮细胞都有 TLR9表达；且发生宫内感染的胎盘组织较未发生宫内感染者TLR 9的表达更强、更广泛。同时，发生HBV宫内感染的产妇血清中TLR 9水平显著高于发生宫内隐匿性感染和未发生宫内传播的产妇，提示孕妇外周血中的HBV可能激活和增强胎盘细胞的TLR 9的表达，TLR 9 表达水平越高其发生宫内感染概率越高。⑤人群研究中发现：283例HBsAg阳性产妇所生的287例新生儿中有26例HBsAg为阳性，即HBV宫内感染率达9.06%，有124例新生儿HBsAg为阴性且HBV DNA为阳性，即HBV宫内隐匿性感染率高达43.21%。⑥HBsAg阳性产妇以HBV C型为主，B型和C型发生宫内传播概率无明显差异。⑦HBsAg阳性产妇中血清型特征以小三阳为主，但是大三阳产妇发生宫内感染概率显著高于其他类型HBsAg阳性产妇。其中产妇HBV DNA载量、产妇家族患有乙肝的家族史和新生儿HBV DNA载量与HBV宫内感染发生有显著关系。⑧在病毒序列分歧时间分析中发现，宫内感染可以发生在孕期的各个阶段，主要发生在妊娠中晚期。本项目研究结果显示产妇体内乙肝病毒无论是B基因型还是C基因型，随着病毒滴度增加，对胎盘屏障的攻击、破坏可能性增加；并且随着妊娠时间增加，发生宫内传播概率也增加，因此，HBV宫内感染大多发生在妊娠中晚期；此外，研究发现TLR 9是预测是否发生HBV宫内感染的一个潜在指标，为宫内感染早期预防与发现提供了理论依据。