青枯菌致病过程中双组分反应调节子HrpG和PrhG动态调控hrpB基因转录表达的分子机理研究

As in many Gram negative phytopathogens, the hrp regulon and its encoding type III secretion system are essential for the pathogenicity of Ralstonia solanacearum on host plants. The hrp regulon is controlled by HrpB and the hrpB expression is activated by both HrpG and PrhG. Our present research revealed that PhcA regulates prhG expression positively, but regulates hrpG expression negatively. It is intriguing that, as a result, the expression of hrpB is regulated by the PhcA in an opposite ways. Based on the expression characteristic of hrpG and prhG at different cells densities, we hypothesize that R. solanacearum might switch from HrpG to PrhG for hrpB activation in a cell density-dependent manner, and PrhG mainly works in the xylem vessels of higher cell densities. It is the fist time to propose the idea of dynamical regulation on the pathogenesis of R. solanacearum in the world. PrhG and HrpG share high homologous, and both them belong to the OmpR/PhoB family of two-component response regulators. For the OmpR family of response regulators, they usually form dimmers and bind to the target DNA to activate the expression of the downstream genes. So we speculate that PrhG and HrpG will form diverse dimmers at different cell densities, and activate the hrpB expression by binding to the target DNA. Here we take this proposal to investigate their possible dimerization with gel filtration chromatography, western blot and immunoprecipitation, and analyze their target binding sites on hrpB promoter with EMSA and magnetic DNA affinity purification. It aims to reveal the molecular mechanism of the regulation on hrpB transcription and confirm our hypothesis. It can also provide new insight into the understanding on the global regulation network in R. solanacearum and the control of bacterial disease on plants.

PhcA、PrhG、HrpG和HrpB是青枯菌致病调控网络的重要因子，PrhG和HrpG高度同源，同属OmpR家族双组分反应调节子, 都正调控hrpB表达，我们发现PhcA正调控prhG但负调控hrpG表达，使得hrpB表达被PhcA正负双向调控。进一步研究发现hrpG和prhG分别在不同细菌浓度下表达，因此我们首次提出青枯菌根据自身浓度不同切换HrpG和PrhG动态调控hrpB表达的观点。鉴于OmpR反应调节子多形成二聚体，我们推测二者在不同浓度以不同二聚体形式结合靶DNA，动态调控hrpB表达。本课题以此为出发点，拟采用凝胶过滤层析、western blot、免疫沉淀等研究二者不同浓度时的二聚体形式，用EMSA、DNA亲和沉淀等鉴定二者结合hrpB启动子的位点，旨在揭示二者调控hrpB表达的分子机理，证实我们动态调控的论断，为深刻了解青枯菌致病全局调控和植物细菌病害的控制提供新思路。

青枯菌可导致多种重要经济作物毁灭性枯萎，严重威胁世界农业经济发展。青枯菌通过对寄主植物信号应答，逃避寄主防卫反应，运用精密网络对各侵染环节进行全局性调控以产生致病性。注射器状的三型分泌系统（Type III secretion system，T3SS）是该网络的一个重要因子，青枯菌T3SS受AraC家族转录调控因子HrpB的直接控制，而hrpB 的转录表达受OmpR/PhoB家族二组分反应调节子HrpG和PrhG共同正向调控。青枯菌prhG和hrpG的转录表达分别受LysR家族转录因子PhcA的正负双向调控，这使得hrpB的表达同时受到PhcA的正负双向调控。因此，研究HrpG和PrhG动态调控hrpB基因转录表达的分子机理有助于我们进一步了解青枯菌对寄主植物的侵染过程，可为青枯病和其它植物细菌病害的防治提供新思路。鉴于PhcA的群体效应特性，我们研究了青枯菌PrhG在不同浓度情况下，在寄主植物体内、体外对hrpB及T3SS基因表达的影响，得出了枯菌可能根据自身浓度变化切换HrpG 和PrhG 对hrpB及T3SS基因表达进行动态调控以促进致病过程发生的重要论断。HrpG和PrhG高度同源（72%的氨基酸一致性），但二者对hrpB基因表达及对寄主致病的调控却差别很大。其中PrhG较HrpG多出约50个氨基酸，而该部分多出的氨基酸主要位于PrhG的C末端，本研究通过基因敲除、功能互补等方法发现PrhG较HrpG多出的这50个氨基酸，严重阻碍了PrhG对hrpB转录表达及致病性的调控。我们还发现了2个新的影响hrpB及T3SS基因表达的因子（Rsc1285和PrhN）,并揭示了其参与调控hrpB及T3SS基因表达的分子途径，丰富了青枯菌侵染寄主植物致病的全局性网络。此外，我们也纯化了HrpG和PrhG蛋白，并用EMSA研究HrpG和PrhG在不同情况下对hrpB启动子的结合，结果发现在E. coli BL21（DE3）表达纯化的HrpG和PrhG蛋白并不具有结合hrpB启动子的能力，而通过DNA Pull Down Assay，我们发现利用hrpB启动子捕获的蛋白中鉴定出了HrpG和PrhG，这表明HrpG和PrhG可结合hrpB启动子，但E. coli中可能缺乏可使HrpG和PrhG磷酸化的感应激酶，因而影响了二者对hrpB启动子的结合，该部分实验正在进行中。