青枯菌中Prt1蛋白对青枯素生物合成的转录调控

Ralsolamycin is one kind of inter-kingdom communication signal, which is produced by Ralstonia solanacearum and plays a key role in inducing interactions between R. solanacearum and fungi. We have found that the encoding gene expression level and production of ralsolamycin were decreased significantly when the prt1 gene was mutated, but the molecular mechanism of Prt1 protein modulating ralsolamycin biosynthesis is still vague. Result of EMSA experiment further demonstrated that Prt1 protein was not bind to the promoter sequence directly. Thus, we infer that other regulatory gene may involve in the ralsolamycin biosynthesis pathway. In this project, to further identify the key genes that modulated by Prt1 and involved in the ralsolamycin biosynthesis, the RNA-seq, gene deletion and functional complementation, qRT-PCR verification, EMSA, DNaseI footprinting assay, LC-MS detection and R. solanacearum-fungi interaction will be conducted. Finally, regulation mechanism of ralsolamycin biosynthesis by Prt1 will be clarified. On the basis of expounding the signal regulation pathway, our results can also provide important guidance for the management of the bacterial wilt.

青枯素（ralsolamycin）是一种由青枯菌产生的跨界通讯信号，在青枯菌-土壤真菌互作过程中起重要的作用。我们发现prt1基因突变后，青枯素编码基因的表达量显著下调，青枯素的合成量显著减少。那么，Prt1调控青枯素生物合成的机制是什么？进一步EMSA实验显示：Prt1蛋白并不与青枯素编码基因的启动子区域直接结合。由此，我们提出Prt1调控青枯素生物合成的通路上还涉及其它中间调控因子。本项目拟进一步采用转录组测序、基因敲除和互补、qRT-PCR验证、EMSA、DNaseI足迹实验、LC-MS检测和青枯菌-真菌互作分析等方法，旨在鉴定受Prt1直接调控且参与调控青枯素生物合成的中间调控因子，从而揭示Prt1对青枯素生物合成的调控作用和机制。在逐步摸清青枯菌信号调控通路的基础上，也可以为制定更加有效的青枯病防治策略提供理论指导。

青枯菌素（ralsolamycin）是青枯菌（Ralstonia solanacearum）产生的一种次级代谢产物，青枯菌素可以在青枯菌和环境真菌互作中发挥重要的作用，其可以广泛诱导真菌产生厚垣孢子。已有研究表明青枯菌素是由非核糖体肽类合成酶RmyA和聚肽合酶RmyB催化合成。phc群体感应信号 3-OH MAME or 3-OH PAME的是由一种甲基转移酶PhcB催化产生，申请人前期研究已报道，青枯菌素的生物合成受到phc群体感应系统的正向调控。之前文献报道PhcS和PhcR以双组分的形式来感应phc群体感应信号 3-OH MAME或3-OH PAME，从而进一步激活phcA的表达。PhcA是phc群体感应通路上重要的调控因子。在本研究中，我们通过构建phcA和phcR基因的缺失突变体及其功能互补株，验证了关键调控基因phcA和phcR对青枯菌素生物合成基因rmyA和rmyB基因转录的影响模式，并进一步通过凝胶迁移阻抑实验（EMSA）验证了调控蛋白PhcA和PhcR对青枯菌素的调控模式。最后通过与香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f. cubense (strain FOC4)互作，进一步验证了PhcA和PhcR在调控青枯菌与FOC4互作中的影响。我们发现phcA基因被缺失突变后，青枯菌素合成基因rmyA/B的表达量均显著性下调，MALDI-TOF检测结果表明，在突变体ΔphcA中青枯菌素的量也显著性减少，与香蕉枯萎病菌FOC4互作时，ΔphcA失去了诱导FOC4产生厚垣孢子形成的能力； 我们验证了受体蛋白PhcR在青枯菌素生物合成中的调控作用，我们发现phcR基因缺失后，青枯菌素合成基因rmyA/B的表达量均显著性上调，MALDI-TOF检测结果表明，在突变体ΔphcR中青枯菌素的量也显著性增加，与香蕉枯萎病菌FOC4互作时，相比于野生型，ΔphcR诱导FOC4产生厚垣孢子形成的能力增强；我们通过异源表达，获得了青枯菌中重要调控蛋白PhcR和PhcA，通过EMSA实验进行PhcR和PhcA蛋白对rmy基因簇的启动子序列结合调控实验，我们发现PhcA和PhcR蛋白均可以直接调控青枯菌素的生物合成，但调控模式相反。相关结果拓展了青枯菌中青枯菌素生物合成精巧调控网络的理解，对于青枯病的防控具有重要的指导意义。