基于CRISPR-Cpf1核酸酶的高效水稻基因组定向编辑新系统构建及应用

CRISPR-Cpf1, a new class 2 CRISPR-Cas system reported in 2015, was the simplest CRISPR nuclease system ever discovered. It is different from CRISPR-Cas9 as it can direct sequence-specific cleavage just guided with one single crRNA molecule. In this project, based on CRISPR–Cpf1 novel cleavage features, we aim to resolve the core issue on further development and application of efficient CRISPR-Cpf1 genome editing systems in rice. The research objectives are as follows: 1) establish a highly efficient CRISPR-Cpf1 nuclease multiplex functional platform for precise genome modification in rice and other plants; 2) realize the efficient genome editing at the DNA region with different function, structure and redundancy among the whole rice genome and break through the bottleneck of targeted replacing, targeted insertion and large deletion; 3) create a targeted mutant library of rice NAC transcription factor family and identify the key NAC factors with great values for basic research and breeding application in response to abiotic stress. Successful completion of our proposed research will effectively expand the efficient, reliable and comprehensive application of the CRISPR-Cpf1 system in plant genome editing. It will also provide the theoretical proof, technical support and material basis for rice functional genomic research and germplasm breeding applications based on the CRISPR-Cpf1 system.

2015年报道的CRISPR-Cpf1是一种有别于CRISPR-Cas9的2类CRISPR成员，仅需crRNA单分子定位，即可定向剪切目标DNA，是已发现的最简CRISPR核酸酶。基于其剪切特性，项目申请围绕水稻CRISPR-Cpf1高效基因组定向编辑新系统构建及应用核心问题及关键技术展开工作，实现：1）高效、特异水稻（植物）CRISPR-Cpf1基因组定向编辑多功能平台构建；2）水稻基因组不同功能、结构、冗余度等代表位点定向编辑有效实施，突破定向置换、定向插入、大片段敲除等瓶颈；3）针对水稻NAC转录因子家族创制定向编辑突变体材料库，发掘、鉴定具重要研究及应用价值的水稻非生物胁迫响应相关NAC转录因子。项目申请的实施，可拓展CRISPR-Cpf1在植物基因组定向编辑中的有效、可靠、深度应用，为基于CRISPR-Cpf1的水稻功能基因组研究及种质创新应用提供理论依据、技术支撑及材料基础。

2015年报道的CRISPR-Cas12a（Cpf1）是一种有别于CRISPR-Cas9的2类（class 2）CRISPR成员，仅需一个向导crRNA分子定位，即可实现目标位点定向剪切。依据项目申请书陈述的研究计划，课题组围绕Cas12a等CRISPR-Cas核酸酶水稻基因组编辑新系统构建及应用，主要完成如下研究工作：1）构建了基于LbCas12a_RR/RVR变体、FnCas12a野生型及RR/RVR变体、STU-Cas12a系统及多个Cas12a核酸酶新成员的水稻（植物）基因组编辑新系统；2）基于多样化CRISPR-Cas12a基因组编辑新系统，针对水稻基因组蛋白质编码基因、microRNA编码基因、启动子调控区域等进行了有效编辑；3）针对挖掘、构建的CRISPR-Cas12a水稻（植物）基因组编辑新系统的编辑特异性、编辑效率影响因素等进行了定性、定量评价；4）基于CRISPR-Cas12a基因组编辑平台，创制了水稻OsNACs、细OsCKXs、microRNA等水稻重要农艺性状相关內源基因的多样化有效功能缺失突变体材料，并从中鉴定了具重要育种价值的新等位基因类型；5）基于xCas9、Cas9-NG、SpRY等PAM识别多样化CRISPR-Cas9变体、CRISPR-Cas12b核酸酶等CRISPR-Cas核酸酶新成员、新变体，开发了碱基敲除、碱基替换、多位点编辑等多样化植物基因组编辑新工具，进一步拓展了CRISPR-Cas核酸酶植物基因组编辑技术应用。本项目研究的完成，实现了CRISPR-Cas12a核酸酶水稻（植物）基因组编辑中的有效、可靠、广适应用，为基于CRISPR-Cas12a等CRISPR-Cas核酸酶基因组编辑新系统的水稻功能基因组基础研究及种质创新应用实践提供理论依据、技术支撑及材料基础。