普通小麦面筋品质关键蛋白编码基因克隆与功能标记开发

Gluten quality plays a key role in the improvement of wheat processing quality. Proteomic techniques, including two-dimensional gel electrophoresis (2-DE),high performance liquid chromatography (HPLC), two-dimensional difference gel electrophoresis (2-D DIGE), and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), will be used to characterize the protein profiles between near-isogenic lines, with the same genetic background in combination of high- and low- molecular weight glutenin subunits, with the objectives to: 1) identify the target proteins closely related with gluten quality, and clone their coding genes using the full length with N-terminal amino acid sequence, with the assistance of conventional polymerase chain reaction (PCR); 2) characterize the gene expression on the samples at five grain developmental stages during the post-anthesis periods, corresponding to the cumulative daily average temperatures, to provide insights into biochemical and mechanisms for key grain protein development from qualitative and quantitative characteristics; 3) purify the protein expressed in E. coli with the coding genes of the target protein introduced, to verify the function of the coding genes using flour blending method; and 4) develop the molecular markers based on the SNPs and InDels among allelic variants of the coding genes, and validate the markers using cultivars with good and poor gluten qualities. The applicability of this approach in proteomics will more widely provide important genes and molecular markers for improvement of wheat gluten quality in breeding programs.

蛋白质质量是小麦加工品质改良的关键目标。本项目拟采用双向电泳、高效液相色谱、差异荧光双向电泳和生物质谱等蛋白质组学技术，结合面筋强度和延展性等品质参数分析，对高低分子量亚基组成背景相同、面筋品质差异很大的近等基因系进行谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白等蛋白质组学分析，目的在于：1）鉴定与面筋品质密切相关的目标蛋白质，并克隆其编码基因；2）从转录与翻译水平研究目标蛋白编码基因在籽粒不同发育阶段的表达与调控特征，从蛋白质组成与表达量两个方面探讨面筋品质形成的分子机制；3）构建高效表达载体在E. coli中表达目标蛋白编码基因，回收并纯化表达蛋白，采用实验室体外配粉方法验证其编码基因的功能；4）根据所克隆目标蛋白编码基因的SNP、InDel等变异特征，开发功能标记，通过对现有优质强筋和品质较差品种的分析，验证其有效性；从而为高效改良普通小麦的面筋品质提供理论依据和分子标记。

面筋品质是小麦加工品质改良的关键目标。针对稳定时间、最大抗延阻力、延伸性、拉伸面积等面筋品质参数和面包、面条和馒头等成品品质参数，以冀师02-1/周麦16组合14份近等基因系、藁城8901/周麦16重组自交系群体176份品系、北方冬麦区58份优质品种和413份国内外代表性品种为材料，采用超高效液相色谱等蛋白质组学技术，结合面筋和成品品质参数分析，在90K和660K SNP标记基因型分析基础上，对蛋白质组成、贮藏蛋白组分含量和面筋品质参数、面包等成品品质及其相互间关系进行研究。结果表明，拉伸仪延伸性和最大抗延阻力、不溶性谷蛋白聚合体含量和谷蛋白、醇溶蛋白等贮藏蛋白组分含量及其比例均受1BL/1RS易位的显著影响，不溶性谷蛋白聚合体含量和拉伸面积(r = 0.92, P < 0.001)、延伸性(r = 0.92, P < 0.001)、最大抗延阻力(r = 0.80, P < 0.01)呈显著正相关，面筋品质较好的品系不溶性谷蛋白聚合体含量较高，可作为品质育种的选种指标。CA0493、冀师02-1、12品404、新麦26和Karl等5个品种的面包品质优，其中冀师02-1和Karl的馒头品质也较好，可以作为兼用型品种在品质育种中加以应用。在1AL、1BS、1DL、2AL、5AL、6AS染色体共发现6个与面筋品质参数密切相关且稳定存在的基因/QTL，均可解释表型变异10%以上，并发掘与其紧密连锁的SNP标记。进一步通过在高分子量麦谷蛋白亚基编码基因Glu-1起始密码子前1 kb区域进行顺式作用元件分析，对调控其表达的启动子区进行了研究，发现300 bp启动子即可调控Glu-1在花后7天的起始表达且维持其在种子发育过程中的表达模式，其中-209至-101区段同时控制Glu-1表达水平及其表达的胚乳特异性，为探究顺式作用元件的调控作用奠定了基础。在此基础上，对与面筋品质和面包成品品质密切相关的wbm基因、过表达Bx7OE和Sec-1基因的有效性和实用性进行了验证，确认wbm和Bx7OE可显著提高面筋品质和面包成品制作品质，而1BL/1RS易位显著降低面筋品质；上述基因/QTL的高通量KASP标记将有助于进一步提高小麦品质育种效率。