糖基转移酶UGT51底物选择性机制解析及分子再设计

Structural diversity of sugar moieties can deeply influence the biological activity and pharmacological properties of many natural glycosides. The uridine diphosphate glycosyltransferases (UGTs) have become attractive candidates as biocatalysts for modifying the structures and bioactivities of pharmaceuticals. The catalytic promiscuity of a new glycosyltransferase (UGT51) from S.cerevisiae was explored. UGT51 showed the capability to glucosylate two types of acceptors, sterol and saponin, making it an ideal cadidicate for diversify glycosylation in these compounds. To expand its donor diversify catalytic property, we try to determine the X-ray structures and investigate its substrate recognition mechanism. And then, we will develop a strategy of semi-rational design combined with whole sequence and sites analysis to create novel UGT enzyme with capability of using unnatural donors. This study highlights a potential versatility of UGT51 in the glycosylation of bioactive natural products.

天然糖苷上糖基结构常变化多样,对药理活性有显著影响。糖基转移酶GT-1家族UDP-糖基转移酶(UGT)作为次生代谢途径糖基修饰关键酶，对糖苷药物合成修饰有重要价值。前期我们对酵母糖基转移酶UGT51鉴定发现其除了转糖基甾醇，对皂苷元也有一定活力，后经改造，UGT51对皂苷元的活性获大幅提高，显示在合成修饰药用糖苷类的应用潜力。然而UGT51仅识别UDP-葡萄糖供体，糖基修饰类型单一，局限了在药用糖苷多样性糖基合成修饰中应用价值。本项目拟解析UGT51酶、复合物结构，结合酶动力学，酶家族氨基酸残基共进化分析等技术，深入理解构效关系。进而集中于对影响酶底物选择性的关键位点区域或结构域进行半理性设计，建立小型智能突变库筛选，人为创造催化非天然糖供体的新UGT酶，从而对药用天然皂苷或糖化甾体的合成提供技术支撑。该研究不仅将促进UGT酶家族底物选择性机制深入理解，且会为相关酶分子设计提供科学依据。

UDP糖基转移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）介导的糖基化修饰对天然产物结构及药理活性多样性的形成至关重要。为深入理解UGT糖基转移酶的底物识别及催化机制，易化新的UGT元件酶设计，我们分别在2.77Å、1.90Å和1.85Å分辨率下解析了Apo-UGT51、UGT51-UDP-glucose和UGT51-UDP-PPD的晶体结构。基于结构比对、定点突变和酶动力学，揭示出UGT对底物识别的关键N3及N5Loop区及动态铰链催化机制。通过建立优化糖基转移酶的FACS高通量筛选技术，集中于UGT51酶底物结合关键区域进行迭代饱和突变，获得了对UDP-Gal,UDP-GalNac有识别催化活性的新UGT51突变酶，其中最优突变体M8将UGT51对供体底物UDP-Gal及受体底物原人参二醇PPD活性相对野生型提高约1889倍，kcat/Km达到6.01mM-1s-1，表明了覆盖于UDPG结合位点帽子结构的N1053和R750位点在供体底物识别发挥关键作用。同时利用优良的UGT51新元件酶，设计构建了糖修饰多酶的有序共固定化级联催化体系，40°C反应4小时，转化率可达99%，从而对药用天然皂苷或糖化甾体的合成及衍生提供技术支撑。通过对UGT51酶分子底物选择性、稳定性等催化机制、酶半理性设计及药用糖苷高效合成策略进行了深入研究，力图为GT-1糖基转移酶家族UGT酶分子定向设计和应用提供科学依据。