磷脂膜调节淋巴细胞特异性酪氨酸激酶活化的机理研究

Signal transduction by T-cell receptor (TCR) responding to antigens on Antigen-presenting cell (APC) would trigger the early activation of T cell. Lymphocyte-specific protein tryosine kinase (Lck), which plays an essential role in TCR signaling and T cell development, regulates the phosphorylation of cytoplasmic tail of TCR-CD3 complex and affects the downstream signal diversification and amplification. Current studies present that Lck is anchored in the inner leaflet of plasma membrane and adopts the autoinhibition conformation in the rest state, and its activity is regulated by phosphorylation/dephosphorylation of Tyr394 and Tyr505. However the molecular mechanism of Lck activition is unclear till now. Our preliminary studies show that mechanical force induced by the interaction between TCR and its ligands could assemble the lipids with high negative charges, and the autoinhibition conformation of Lck become unstable in condition of external electric field. Therefore, we propose a hypothesis that the activation of Lck is affected by the assembly of negatively charged phospholipids caused by mechanical force from the TCR-antigen inteaction. In this study, we will make use of the molecular dynamics simulation and single molecule biophysics methods to investigate how plasma membrane, especially the phospholipids with high charges, regulates the activation of Lck in atomic level, reveal the molecular mechanism of Lck relieving its autoinhibition state, and improve the activation mechanism of Lck from single-molecule point of view. Our research will supply the powerful evidences to improve the roles of mechanical force on early activation of T-cell, enrich the theoretical foundation for transmembrane signaling, and provide the theoretical foundations for treating the immunological diseases.

淋巴细胞特异性酪氨酸激酶(Lck)是T细胞受体(TCR)响应抗原而触发的信号跨膜传导通路中的重要环节。Lck调控TCR-CD3复合物胞内域的磷酸化，进而影响后续信号的分化与放大。目前研究表明静息状态下Lck以自抑制状态锚定在质膜内膜上，它的酶活性由两个酪氨酸残基的磷酸化和去磷酸化调节，但是其激活的分子机制还不是很清楚。我们在前期研究中发现TCR与配体相互作用引入的机械力会引起膜中负电磷脂的聚集，且电场会在一定程度影响Lck自抑制结构，所以我们推测负电磷脂会在一定程度上调节Lck的激活。在本项研究中，我们将通过分子动力学模拟和单分子生物物理方法研究Lck在不同环境下的动态特性，磷脂膜对Lck激活的调控以及Lck对CD3模拟域的识别，揭示Lck自抑制消除的分子机制，改进现有的Lck活化机理。我们的研究将有助于完善机械力在T细胞活化过程中的作用机制，为治疗相关免疫疾病提供理论依据。

淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)是T细胞受体(TCR)响应抗原而触发的信号跨膜传导通路中的重要环节。Lck调控TCR-CD3复合物胞内域的磷酸化，进而影响后续信号的分化与放大。目前研究表明静息状态下Lck以自抑制状态锚定在质膜内膜上，它的酶活性由两个酪氨酸残基的磷酸化和去磷酸化调节，但是其激活的分子机制还不是很清楚。. 本项目利用分子动力学模拟及单分子操作方法研究了Lck的激活机制。通过研究Lck自抑制相互作用，我们发现静息状态的Lck上Y505的磷酸化状态对其自抑制强度有调控作用，Y505的去磷酸化可以消除自抑制作用；磷酸基团的质子化可明显削弱其自抑制强度；磷酸基团的非质子化状态增强自抑制强度。这些结果从原子层面说明影响Lck自抑制状态并不稳定，受磷酸化状态调控。TCR体系受力引起质膜的形变，我们的研究发现，细胞膜内膜的高负电磷脂PIP2（二磷酸肌醇磷脂）容易在细胞膜的凹面聚集，并离开其凸面，而PIP及PIP3不会聚集。这些结果说明磷脂膜曲率会特异性的引起PIP2磷脂的聚集。在此基础上，我们研究了不同的磷脂分布对Lck在膜附近的位置分布可能对其功能的作用。结果显示：PIP2致使Lck胞内域远离质膜。UD区域上的负电残基的突变可以消除磷脂组分差异引起的Lck与质膜距离的差异。同时，我们发现 Lck 的UD域有可能与SH2域发生分子内相互作用。根据现有的文献，我们归纳总结了Lck与CD3的相互作用模式，在原子级别建立了Lck与CD3可能的相互作用模型，进而综合现有的研究进展和已经解析的蛋白结构信息，我们构建了TCR复合物的全原子模型。. 我们的研究确定了Lck自抑制状态调控，明确了磷脂和机械力在此过程中的作用，初步总结出了Lck激活的机制。本研究将有助于完善细胞间力信号传导机理，为治疗相关疾病提供理论依据。