三维微环境Wnt/β-catenin通路在胰腺癌化疗耐药中的作用机理

In this study, we investigated the relationship between chemoresistance in pancreatic adenocarcinoma cells of MCTS and Wnt/β-catenin signaling pathway in the three-dimensional culture. Wnt signaling pathway has been reported to be involved in embryonic development and cancer development in recent years. Our previous study found that the cells based on single-layer in two-dimensional model were shown to exhibit significantly higher chemosensitivity in vitro than the cells with in a three-dimensional growing model.Pancreatic cancer cells, in three-dimensional culture, were used for assessing the chemoresistance and Wnt/β-catenin signaling pathway activity.We studied the mechanism of Wnt/β-catenin signaling pathway for pancreatic cancer chemoresistance in the three-dimensional cancer microenvironment with real-time quantitativeRT-PCR and Western blotting. Reporter assays were used for Wnt/β-catenin signaling pathway activity, in which TOPflash or FOPflash.We chose rWnt3a and rDkk-1 for alternating the Wnt signaling pathway activity. rWnt3a was used as agonist and rDkk-1 as antagonist.we investigated chemoresistance in pancreatic cancer at pancreatic cancer cellular level, animal studies of pancreatic adenocarcinoma and pancreatic cancer patients clinical study.The purpose of our study tried to provide the relationship between pancreatic cancer resistance to chemotherapy and the signaling pathway.

项目以三维微环境中调控胚胎发育和肿瘤发生的共同途径Wnt/β-catenin通路为切入点，结合我们前期研究:更接近于体内肿瘤状态的三维微环境中胰腺癌细胞化疗敏感性与平面模型有显著差别，但其化疗耐药机制仍未明确。项目拟在前期基础上，从三维细胞模型，Wnt通路在不同化疗药敏特性球体细胞中活性及Wnt通路对化疗耐药调控机理三方面入手，首先利用三维培养多细胞球体作为理想的化疗模型，接着用荧光素酶报告系统检测不同药敏特性球体Wnt通路活性, 同时采用RT-PCR及Western blot在体内和体外实验体系深入分析不同药敏特性球体Wnt通路β-catenin及其下游靶基因与蛋白表达差异。接着分别激活和阻断Wnt通路，调节其活化状态，观察其对化疗敏感性的变化和对下游靶基因及蛋白表达的影响，同时利用动物模型结合患者标本以期在细胞模型，动物实验，患者研究三个水平探索信号传导网络对胰腺癌化疗耐药的调控规律。

项目背景: Wnt/β-catenin信号通路是一条对控制胚胎发育起重要作用的信号途径，研究表明胚胎发育期起关键作用的Wnt/β-catenin信号通路在胰腺癌等诸多肿瘤形成及化疗中亦起重要作用。此外近来研究显示肿瘤微环境的变化对胰腺癌化疗耐药有重要影响。鉴于此，我们设想在建立更接近于体内肿瘤微环境的三维多细胞球体基础上，以调控胚胎发育和胰腺癌发生的共同途径Wnt/β-catenin信号通路为切入点，研究其在胰腺癌化疗耐药中的作用机理，以期在信号传导层面揭示胰腺癌化疗耐药的相关基因表达和调控规律。.主要研究内容: 项目以三维微环境中调控胚胎发育和肿瘤发生的共同途径Wnt/β-catenin通路为切入点，从三维细胞模型，Wnt通路在不同化疗药敏特性球体细胞中活性及Wnt通路对化疗耐药调控机理三方面入手，首先利用三维培养多细胞球体作为理想的化疗模型，接着采用RT-PCR及Western blot在体内和体外实验体系深入分析不同药敏特性球体Wnt通路β-catenin基因与蛋白表达差异，观察其对化疗敏感性的变化和对下游靶基因及蛋白表达的影响，同时利用患者标本以期在细胞模型与患者研究水平上探索信号传导网络对胰腺癌化疗耐药的调控规律。.重要结果: 1.完成三维培养构建胰腺癌多细胞肿瘤球体(MCTS)模型.2加入化疗药物，针对不同细胞在平面二维环境及三维培养构建胰腺癌多细胞肿瘤球体(MCTS)模型中实验检测的化疗敏感性. 3.Wnt通路中关键因子β-catenin蛋白的相关研究. 4.β-catenin的mRNA表达研究。5胰腺癌患者样本研究:术后胰腺癌标本原代细胞MCTS培养. 6利用CD-DST技术三维立体培养药敏检测，对患者实施健择或5-FU化疗。7.免疫组化观察癌与癌旁组织Wnt信号β-catenin表达. 8对实施健择或5-FU化疗的胰腺癌患者定期随访，定期行CT等影像学检查及肿瘤标记物检测，观察患者无瘤生存率（PFS）及总生存率（OS）进行临床评估。.科学意义: 本课题通过三维细胞培养模型MCTS模型，系统性的从组织细胞水平与胰腺癌患者研究水平探讨了影响胰腺癌化疗敏感性的相关机理，可以对胰腺癌体内化疗有一个更加直观全面的认识，指导下一步的研究方向，为进一步的研究提供实验依据。同时使用CD-DST技术是将手术切除的肿瘤组织或细胞在体外三维培养，从而筛选出个体化的药物配