线粒体同源转化的甘蓝Ogura胞质不育系质核互作的分子机制

细胞质雄性不育系统(CMS,cytoplasmic male sterility)是研究植物花粉发育和核质互作的理想材料。通过构建萝卜Rfo（Ogura CMS fertility restorer）基因PPR-B的组成表达载体和CMS不育基因orf138的线粒体定位表达载体，对发生线粒体同源转化（cytoplasmic homeosis）的甘蓝Ogura胞质不育系及其保持系遗传转化,进行基因功能互补研究；在鉴定转基因植株雄蕊表型变化的基础上，利用RT-PCR的方法分析甘蓝花器官发育基因B和C在发生线粒体同源转化的甘蓝Ogura胞质不育系和保持系转基因前后不同发育阶段花蕾时空表达差异的变化。通过以上研究，阐明发生线粒体同源转化的甘蓝Ogura胞质雄性不育系质核互作的分子机制，深入了解植物花器官的形态建成及其发育调控过程，并探索植物雄性不育发生的分子机理，为其在农业生产上的应用奠定理论基础。

高等植物花粉发育主要是受核基因组基因直接调控，迄今为止，未有线粒体蛋白及RNA可以从线粒体直接输出的报道。因此，线粒体不能直接调控花粉发育，但在胞质不育系统中，线粒体基因重排可以通过线粒体信号途径反向调控核同源异型基因导致花器官同源转化。为揭示甘蓝Ogura胞质雄性不育系的发生线粒体同源异型转化的分子机制，根据植物花器官发育的ABC模型，首先利用RT-PCR方法对发生线粒体同源转化的甘蓝Ogura胞质雄性不育系的花器官发育基因B和C的时空表达状况进行了分析，结果表明甘蓝B基因AP3在雌蕊（心皮）发育初期异位高表达和C基因AG3在心皮化雄蕊异位高表达，这可能是甘蓝Ogura胞质不育系线粒体同源转化的发生原因。为了进一步深入了解甘蓝Ogura胞质不育系发生线粒体同源转化前后基因转录和表达水平上的动态变化，我们选择了心皮化雄蕊（BO_S）和雌蕊（BO_C）这两个花器官发育的关键时期进行RNA-SEQ研究，获得有功能注释Unigenes 42646个，筛选出326个差异表达基因。差异表达显示，与雌蕊（BO_C）相比，与雄蕊心皮化相关的基因如甘蓝类Agamous同源异型基因(Bo AP1-A)，与线粒体可变剪切功能相关的二羧酸载体蛋白，结合钙离子的EF hand 蛋白家族基因，乙烯反应转录因子，锌指蛋白等基因在心皮化雄蕊（BO_S）特异高表达。为了研究甘蓝Ogura胞质雄性不育系发生线粒体同源转化前后其不育基因是否发生了改变，我们对ORF138基因进行同源克隆，发现它与甘蓝Ogura胞质雄性不育基因orf138序列完全相同，这说明ORF138的表达与甘蓝是否发生线粒体同源转化无关。为了证实ORF138是甘蓝Ogura胞质雄性不育发生的关系，构建了CaMV35S启动子驱动的ORF138与烟草线粒体定位肽ATP2-1融合表达载体（3301-ATP-orf138-Bar），拟南芥转基因研究实验表明ORF138能导致拟南芥雄性不育的发生，这说明ORF138蛋白是发生线粒体同源异型转化的甘蓝Ogura胞质雄性不育系不育的决定因素。在基金项目的资助下，建立和优化了甘蓝的组培再生体系，发现了甘蓝外植体的子叶-子叶柄和下胚轴的最佳再生培养基，其最高再生率分别为90%和74.07%。此外，还分析了甘蓝小孢子诱导成胚的关键影响因素，优化了结球甘蓝游离小孢子培养技术体系。