新疆火焰山热稳定、高活性细菌纤维素酶的基因克隆、定向进化及其热稳定机制解析

Cellulases are relatively costly enzymes, and have wide industrial applictions in many field, such as textile, paper making, and bioenergy. Currently, most commercial celluases are of fungal origin (Trichoderma species and Aspergillus species), and these enzymes have some universal drawbacks, including low activity in alkaline condition, sensitive to high temperature, and high production cost. Recently, bacterial cellulases have become a hotspot of cellulase research due to its tolerance to high temperature, neutral or alkaline pH optimum, and low production cost. To find novel cellulases from unculturable microorganisms in extreme environment, metagenomic libraries will be constructed in this study using soil samples from the Flame Mountain of Xinjiang province-the hottest place in China. Library screening will be performed subsequently to obtain bacterial cellulase with thermostability and high-activity, followed by error-prone PCR and DNA shuffling to discover the key sites underlying thermostability of the cellulase. Then, x-ray diffraction technology will be used to analyze the three-dimensional structures of wild-type and mutated enzyme. Finally, the structural features and molecular mechanisms related to thermostablility of bacterial cellulases will be elucidated by analyzing the distribution and location effect as well as the hydrophobic effect of mutation sites, and effects of mutation sites on the form of hydrogen bonding, disulfide bonding, and ion pairing.This study will provide a new method and insight for studying thermostable mechanism of cellulases and exploiting cellulase resources from extreme environments, and thus has theoretical significance and tremendous application potential.

纤维素酶在纺织、造纸、新能源等领域具有广阔应用前景。现有纤维素酶多来自真菌，普遍存在碱性条件酶活低、不耐高温、生产成本较高等缺点。而细菌纤维素酶很好地弥补了真菌纤维素酶的上述缺点，因此对它的研究已成为纤维素酶研究中的一个热点。为从极端环境中的未培养微生物中寻找新型纤维素酶，本研究拟从中国最热地区-新疆火焰山的土壤样品中建立宏基因组文库，并筛库获得热稳定、高活性的细菌纤维素酶。然后联合应用易错PCR和DNA改组技术确定与酶的热稳定性相关的关键位点，并利用X-射线晶体衍射技术解析野生酶和突变酶的三维结构。最后，通过分析突变位点在蛋白质三维结构图上的分布和位置效应、突变位点的疏水效应、以及突变位点对氢键、二硫键和离子对形成的影响，阐明细菌纤维素酶热稳定的结构特征和分子机制。本研究为探索纤维素酶的热稳定机制以及开发极端环境中的纤维素酶资源提供了新的方法和思路，具有重要的理论意义和应用潜力。

纤维素酶在纺织、造纸、新能源等领域具有广阔应用前景。本项目围绕从新疆火焰山极端环境的土壤中获得热稳定、高活性细菌纤维素酶并解析其热稳定分子机制的研究目标，建立了库容量高达10万个转化子的新疆火焰山土壤宏基因组表达文库，其包含的微生物DNA的信息量约为480MB。采用功能筛选方法，对文库中的纤维素酶阳性克隆进行了筛选，最终获得两个新的、酶活和热稳定性较好的β-葡萄糖苷酶Bgl1455和Bgl1932。然后建立了两个β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌异源表达系统，使其在大肠杆菌中得到了高效表达。进而探索了pH、温度、金属离子、有机溶剂、表面活性剂、葡萄糖等对酶活的影响，并对它们的动力学参数进行了测定。为了阐明所得纤维素酶的热稳定机制，以bgl1455作为模板，连续进行了三轮易错PCR和一轮DNA改组，最终从突变文库中获得了一株发生了7个氨基酸替换（E120D，I138P，V325L，T68K， D371H， S196P， T251N）的突变酶Bgl1455ms416，其热稳定性比野生酶显著提高。利用Swissmodel同源建模技术对突变前后酶的三维结构进行了比较和分析，从而确定了与纤维素酶的热稳定性相关的关键氨基酸位点分别为第196位氨基酸、325位氨基酸和371位氨基酸。利用X-射线晶体衍射技术，建立了Bgl1455和突变酶Bgl1455ms416的三维晶体结构。通过对突变位点的位置效应分析，突变酶热稳定性显著提高的分子机制被归纳为以下四个原因：①通过氨基酸侧链疏水效应的增强，提高了酶的稳定性；②形成更多的氢键，稳定了突变位点周围容易摆动的loop区；③增加了结构的局部刚性，在催化主链上形成一个连续的氢键网络；④增加了酶的催化中心周围的盐桥数目。本研究为探索纤维素酶的热稳定机制以及开发极端环境中的纤维素酶资源提供了新的方法和思路，具有重要的理论意义和应用潜力。