红树林环境宏基因组文库中新型漆酶基因克隆及功能研究

漆酶在环境保护、造纸工业、新能源开发等领域具有广泛应用潜力。然而，目前研究的绝大部分漆酶都来自真菌，这主要因为迄今只在几种可培养的原核生物中发现了漆酶基因。因此对细菌漆酶基因的克隆和功能研究亟待加强。为了从占微生物种类99%以上的未培养微生物中寻找新型细菌漆酶基因，申请人在前期研究中首先进行了宏基因组文库的构建与功能基因筛选研究，并克隆到一个酶活高、热稳定性好、pH范围广的新型酯酶基因。基于这些工作基础，我们在本课题中拟从微生物资源丰富而独特的红树林环境样品中建立宏基因组文库，结合SIGEX（底物诱导的基因表达筛选）方法进行高通量筛选以获得新的细菌漆酶基因，然后进行酶学性质的研究，并利用随机分子突变技术，确定与酶活中心相关的关键位点，最终阐明新型漆酶的功能。研究结果不仅获得了具有新功能特性的漆酶，而且为发现新型细菌漆酶基因提供了新的思路，因此具有重要的理论意义和应用潜力。

利用p18GFP和pUC118载体以及高效电击法分别构建了库容量达5500、8000个克隆的两个宏基因组文库。经过文库筛选，最终从文库中获得一个新的全长为1.5 kb的细菌漆酶基因lac591。对该基因进行了原核表达和重组蛋白的酶学性质研究。结果显示，重组漆酶的表达量高达380 mg/L，酶对2,6-二甲基苯酚的比酶活为12.73 U/mg，并对几种经典的漆酶底物也显示了较高的活性。该酶的最适pH为7.5，在pH7.0-10.0范围内酶活稳定。其最适温度是55°C，在50°C以下酶活稳定。另外，研究了该酶对不同底物的kcat和Km的大小。结果表明，催化效率最高（0.28S-1μM-1）的2,6-二甲基苯酚是该酶的最佳底物，其余最佳底物的顺序依次为：邻苯二酚>α-萘酚>愈创木酚>丁香醛连氮>ABTS。为进一步改善该酶的活性和酶学特性，以野生型酶基因为模板，利用易错PCR技术建立了突变文库。通过连续三轮易错PCR及筛库，最后筛选到一个发生了四个氨基酸替换（E316V，F62L，N40S，V55A）的漆酶突变株Lac3T93，其酶活较野生型提高4.8倍。另外，突变酶Lac3T93的最适温度和最适pH分别从野生型酶的55°C和7.5提高到60°C和8.0。对突变酶进行了三维结构的同源建模，三维结构图显示，突变位点V55A和F62L距离漆酶的活性中心较远，位于漆酶蛋白的表面或环状区域，而N40S和E316V两个突变位点没有显示在三维结构中。另外，突变酶对四种工业染料的降解率分别从野生型酶的10%、26%、49%、61%提高到26%、55%、79%和83%，而突变酶对靛红染料的完全降解时间则由60分钟缩短至40分钟。此外，Lac3T93对木质素的降解率从野生型酶的10%提高到15.3%。但是在加入另外两种酶（黄孢原毛平革菌锰过氧化物酶和灰盖鬼伞菌过氧化物酶）后，木质素的降解率高达68.5%，比不加入漆酶的两种酶的木质素降解率（48.9%）提高19.6%，表明加入漆酶后的复合酶系可更高效地降解木质素。