面向癌症精准诊疗的高密度微腔阵列式多重数字PCR芯片

The identification of genetic mutations in cancer patients is key to cancer precision therapy. Recently, the analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) in plasma is regarded as one of the most important diagnostic tools for cancer precision therapy due to its non-invasive, convenient, and specific properties. However the conventional ctDNA detection methods have insufficient sensitivity or patient coverage for broad clinical applicability due to very low ctDNA level and tumor heterogeneity. Now, the advent of digital PCR has greatly improved the precision and sensitivity of mutated gene measurements, which shows promise for the noninvasive detection of cancers. Although digital PCR technique has been shown to be promising, it still has some shortcomings for the clinical practices, such as expensive instrumentation, complicated procedure, and poor multiplexing capability. This program presents a novel digital PCR chip based on the high-density and multi-area microcavity array combined with a power-free pumping to overcome the bottlenecks of the current digital PCR. Without requiring any external connections or pumping equipments, this chip allows low-cost and easy-to-use detection of ctDNA, which greatly improves the clinical practicability of digital PCR. Such simple and efficient approach holds promise to provide an efficient tool for cancer precision therapy.

获取患者的基因变异信息是实现癌症精准治疗的关键。近年来具有简便、无创优势的循环肿瘤DNA（ctDNA）检测被视为实现癌症精准诊疗突破的重要手段。但是由于患者外周血中ctDNA含量极低且肿瘤遗传变异存在异质性和复杂性，目前常规基因诊断技术的灵敏度和准确性还难以满足ctDNA临床检测的需求。最近，高灵敏度的数字PCR技术的出现，为基于ctDNA检测的癌症精准治疗带来了希望，显示了很好的临床应用前景。但是现有数字PCR平台存在一些严重不足，如昂贵的仪器装备、复杂的操作流程和较弱的多重检测能力等，影响了该技术在临床实际中的应用。本项目拟研究一种新型多重数字PCR芯片，该芯片利用高密度微腔阵列结合无源微流体驱动技术实现样品的数字化分解，同时采用分区预存引物实现多重PCR检测，可很好地克服现有数字 PCR 技术在临床实际应用中的关键瓶颈问题，有望为临床肿瘤的精准医疗提供一种有效的分子生物学检测手段。

获取患者的基因变异信息是实现癌症精准治疗的关键。近年来具有简便、无创优势的循环肿瘤DNA（ctDNA）检测被视为实现癌症精准诊疗突破的重要手段。但是由于患者外周血中ctDNA含量极低且肿瘤遗传变异存在异质性和复杂性，目前常规基因诊断技术的灵敏度和准确性还难以满足ctDNA临床检测的需求。最近，基于微流控技术的高灵敏度数字PCR技术的出现，为基于ctDNA检测的癌症精准治疗带来了希望，显示了很好的临床应用前景。但是现有数字PCR平台存在一些严重不足，如昂贵的仪器装备、复杂的操作流程和较弱的多重检测能力等，影响了该技术在临床实际中的应用。本项目针对现有数字PCR系统的上述局限开展了一种简易多重数字PCR芯片的研究，主要研究内容包括：①针对数字PCR技术对PCR反应体系大规模数字化分解的需求，以及微纳尺度下液滴易于挥发的问题，成功设计并制作了具有低挥发性能且集成高密度皮升级微腔阵列的数字PCR芯片（8×20000个微腔）；②探索基于PDMS薄膜透气特性结合预脱气处理的简便微流体操控技术，建立了基于微腔阵列结合表面张力作用的规模化液样快速数字化分解新方法，成功实现了液样在高密度微腔阵列中的无源快速分配（分配时间<10min）；③探索基于微腔充样结合冷冻干燥方法的扩增引物分区预储存技术（8重检测），建立了可实现多重数字PCR检测的技术方案。本项目所研制的芯片通过结合高密度微腔阵列和预脱气集成式“真空微泵”技术成功实现了样品的快速、自动的数字化分解，同时也成功实现了芯片上多重引物的分区预存储技术方案，为下一步实现多重数字PCR检测奠定了技术基础，可很好地克服现有数字 PCR 技术在临床实际应用中的关键瓶颈问题，有望为临床肿瘤的精准医疗提供一种有效的分子生物学检测手段。另外，本项目研究过程中共发表论文18篇（其中SCI论文9篇），申请专利1项，培养研究生4名（其中博士生1名，硕士生3名）。