BmABCD2基因在家蚕抗BmNPV中的作用机制研究

It is very important to identify the resistance gene to Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus (BmNPV). We have screened a candidate gene, ATP-binding cassette sub-family D member 2 (BmABCD2), based on the primary mapping results of the high resistance variety BaiyuN. In order to further study the molecular mechanism of BmABCD2, firstly, we will clone the complete sequence of BmABCD2 by RACE. The expression profiles of BmABCD2 will be detected by using fluorescence quantitative PCR in the different tissues of the resistant and susceptible varieties after infected by BmNPV. Then, we will confirm the BmABCD2 gene’s function at the cell and individual level by using CRISPR/Cas9 method. Finally, the interacting proteins of BmABCD2 will be identified by co-immunoprecipitation techniques, and validated by yeast two-hybrid method. This study has a positive theoretical and practical significance for the interpretation of the anti-virus mechanism of the silkworm and the breeding of the resistance silkworm variety.

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）抗性基因的鉴定对抗病毒研究十分重要。申请人基于对BmNPV高抗性品系白玉N基因定位结果，筛选到了一个候选基因Bombyx mori ATP-binding cassette sub-family D member 2 （BmABCD2），目前对其基因序列及功能信息尚不清楚。为进一步研究BmABCD2的抗病毒机制，本项目首先利用RACE技术克隆其全长，阐明其序列特征；然后实时定量PCR检测BmABCD2在不同抗性家蚕品种感染BmNPV后的表达特征；进一步在细胞水平和蚕体水平上利用CRISPR/Cas9技术鉴定该基因在家蚕抗BmNPV中的功能；最后通过免疫共沉淀和酵母双杂交技术筛选并鉴定BmABCD2的互作蛋白，解析其在家蚕抗BmNPV感染过程中的作用途径和机理。本研究对阐释家蚕抗病毒机制和家蚕抗性育种选育有积极的意义。

由家蚕核型多角体病毒(BmNPV) 引发的家蚕血液型脓病是对蚕业生产危害最为严重的一类恶性传染性疾病，该病传染性极强，常呈爆发态势，难以控制，每年由此病给蚕业生产带来的损失大约占蚕病损失的70%左右。因此，获得BmNPV抗性关键基因，开展家蚕对BmNPV的抗性机制研究和培育家蚕抗BmNPV品种具有重要的理论和实践意义。本项目通过基因组重测序和分离群体定位鉴定出位于第27连锁群上的BmABCD2基因，获得了BmABCD2基因在家蚕BY和BYN品种中的cDNA全长，分别为3430 bp和3258 bp，都编码一个由754个氨基酸组成的蛋白质，但起始和终止位置不同，在非编码区存在SNP位点差异。检测了BmABCD2基因的时空表达模式，BmABCD2基因表达于整个变态发育时期，且各组织中均有表达，在BmNPV侵染后抗性品种的中肠、脂肪体等组织相对表达量诱导性上调。在细胞水平和个体水平上验证了BmABCD2的抗病毒功能，过表达BmABCD2能抑制BmNPV增殖，而干涉BmABCD2则促进了BmNPV增殖。筛选到15个与BmABCD2互作蛋白，结合高通量组学测序，鉴定到包括ABC转运、氧化磷酸化等的信号通路。BmNPV进入家蚕抗性品种BYN细胞后，BmABCD2的表达量呈现诱导性上调，同时调动了能量代谢等信号通路激发了免疫系统的协同对抗，抑制了病毒的增殖复制，使病毒浓度维持在一个较低水平，从而表现出了对BmNPV的高抵抗性。